Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

Summary

Dieses Manuskript beschreibt Standardprotokolle zur Messung der Hyperphosphorylierung Tau, Tau Bindung an Mikrotubuli und Lokalisierung von intrazellulären Tau nach medikamentösen Behandlungen zu messen. Diese Protokolle können wiederholt verwendet werden, für das screening von Drogen oder andere Substanzen, die auf Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli binden.

Abstract

Die Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau ist ein neuronalen Protein, das vor allem in Axone lokalisiert. Im Allgemeinen ist Tau für normale neuronalen funktionieren, da es bei der Montage von Mikrotubuli und Stabilisierung beteiligt ist. Neben Neuronen ist in menschlichen Brust-, Prostata-, Magen-, Darm-, und Pankreaskarzinome wo es zeigt fast ähnlichen Struktur und ähnliche Funktionen ausübt, als die neuronalen Tau Tau ausgedrückt. Die Höhe der Tau und die Phosphorylierung kann ändern ihre Funktion als Stabilisator von Mikrotubuli und führte zur Entwicklung der gekoppelten spiralförmigen Filamente in verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer. Ermittlung des Tau und die Mikrotubuli-Bindungseigenschaften Phosphorylierung ist wichtig. Darüber hinaus ist es wichtig bei verschiedenen Krankheiten, untersuchen die intrazelluläre Lokalisation der Tau. Dieses Manuskript Details Standardprotokolle zur Messung der Phosphorylierung von Tau und Tau Bindung an Mikrotubuli in colorectal Krebszellen mit oder ohne Curcumin und LiCI Behandlung. Diese Behandlungen können eingesetzt werden, um Krebs Zellproliferation und Entwicklung zu stoppen. Intrazelluläre Lokalisation der Tau wird mithilfe von Immunohistochemistry und konfokalen Mikroskopie mit geringen Mengen von Antikörpern untersucht. Diese Tests können wiederholt verwendet werden, für das screening von Verbindungen, die Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli Bindung auswirken. Neuer Therapeutika für verschiedene Tauopathies oder Verwandte Anti-Krebs-Agenten können potenziell charakterisiert werden, mit Hilfe dieser Protokolle.

Introduction

Tau wurde ursprünglich als hitzebeständig Mikrotubuli-assoziierten Protein identifiziert, das Co gereinigtem Tubulin¹war. Tau wird ausschließlich in höheren Eukaryoten^2,3,4angegeben. Die Hauptfunktion des Tau ist, Mikrotubuli Montage^1,5,6zu kontrollieren. Es trägt auch zur Polymerisation von Mikrotubuli⁷, axonalen Transport⁸, Veränderungen der axonalen Durchmesser⁹, Bildung von Neurom Polarität und Neurodegeneration¹⁰. Tau fungiert auch als Protein Gerüst, einige Signalwege zu kontrollieren. Ratte Gehirn Studien deuten darauf hin, dass Tau Neuron-spezifische und dass es in erster Linie in Axone¹¹lokalisiert. Da Tau für Mikrotubuli Polymerisation und neuronale Entwicklung unabdingbar ist, war Tau vermutet, um eine wichtige Rolle in der axonalen Entwicklung in das zentrale Nervensystem; Diese Hypothese wurde später von in Vitro und in Vivo Experimente verifiziert. Neben der Neuronen drückt sich Tau in verschiedenen nicht-neuronale Zellen, einschließlich Leber, Niere und Muskel Zellen^12,13. Tau drückt sich auch in menschlichen Brust-, Prostata-, Dickdarm-, Magen-, und pankreatischer Krebs Zelle Linien und Gewebe^{14,15,16,17,18, 19}. Tau findet sich auch in Einbeziehung Körper Myositis als verdrehte Tubulofilaments Einschlusskörperchen²⁰.

Tau kann mehrere post-translationalen Modifikationen vornehmen. Phosphorylierung ist alle post-translationalen Modifikationen die am weitesten verbreitete. Erhöhten Tau Phosphorylierung verringert seine Affinität für Mikrotubuli, schließlich das Zellskelett zu destabilisieren. Fünfundachtzig Phosphorylierung Websites wurden in Tau-Protein isoliert von Hirngewebe menschlichen Alzheimer-Krankheit beschrieben. Dieser Seiten sind 53 % Serin, 41 % Threonin und nur 6 % Tyrosin Rückstände^21,22,23. Tau-Phosphorylierung wirkt sich auf die Lokalisierung, Funktion, Bindung, Löslichkeit und seiner Anfälligkeit für andere post-translationalen Modifikationen. Auch Tau Phosphorylierung um mehr als die normale Ausdehnung (oder vollständig gesättigt mit Phosphatgruppen) ist bekannt als Hyperphosphorylierung, die strukturelle und funktionelle Merkmale der Alzheimer-Krankheit²⁴repliziert. Tau unterhält Funktionsfähigkeit des axonalen Mikrotubuli und sorgt für normale neuronale Funktion unter physiologischen Bedingungen. Hyperphosphoryliertem Tau schlägt jedoch fehl, eine gut organisierte Mikrotubuli binden, was neuronaler Verlust wegen Mikrotubuli Demontage beizubehalten. Ein normales Niveau von Tau Phosphorylierung sind erforderlich für die ordnungsgemäße Funktionsweise Tau, aber Tau nicht, normal zu funktionieren, wenn seine charakteristische Phosphorylierung-Ebene verändert wird und wenn es hyperphosphoryliertem²⁵. In der Alzheimer-Krankheit und einigen anderen altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen Tau wird hyperphosphoryliertem und bildet die gepaarten spiralförmigen Fäden und neurofibrillären Verschlingungen^26,27. Daher sind die Methoden zur Bestimmung von Tau Phosphorylierung und Mikrotubuli binden wichtig.

Colorectal Krebs, eine Alterung verbundenen Krebs ist die dritte am häufigsten diagnostizierte Krebs und der dritte prominente Tod verursacht Krebs für Männer und Frauen²⁸. Darmkrebs ist eine der wichtigsten Tod verursachen Krebserkrankungen in der westlichen Welt²⁹. Weil colorectal Krebs und Alzheimer-Krankheit mit Altern verbunden sind, und beides vor allem in den entwickelten Ländern geschieht, wo die Menschen ähnliche Ernährungsgewohnheiten genießen, können die beiden Krankheiten irgendwie korreliert werden. Darüber hinaus reagieren Tau-Positive und Tau-Negative Krebszellen unterschiedlich auf Chemotherapeutika, z.B., Paclitaxel¹⁶.

Curcumin ist eines der wichtigsten Derivate von Curcuma Longa, die indische Gewürz Kurkuma³⁰. Jahrhundertelang haben die asiatische Populationen Kurkuma in ihrer Ernährung auf einer täglichen Basis verbraucht. Curcumin ist zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Darmkrebs, Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Mukoviszidose, entzündliche Darm-Krankheit, Arthritis, Hyperlipidämie, Arteriosklerose und ischämischen Herzkrankheiten^{31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38}. Lithium auch colorectal Krebszellen zu töten oder zu verhindern, dass ihre Verbreitung³⁹. Lithium kann auch verwendet werden, für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit⁴⁰ wie es Tau Aggregation verringert und die Hyperphosphorylierung verhindert wie in einem transgenen Maus Modell^{41,42,43beobachtet, 44}.

Dieses Manuskript soll: 1) messen Sie die Gesamt-Tau und Phospho-Tau Ausdruck Niveaus im behandelten Zellen; (2) beschreiben Sie eine Phosphatase Test zur Messung der gesamten Tau Phosphorylierung; (3) Mikrotubuli-Bindung von Tau zu prüfen; und 4) lokalisieren Tau konfokalen Mikroskopie in colorectal Krebs-Zelllinien mit Curcumin oder LiCI behandelt. Ergebnisse zeigen, dass Zelltherapie mit Curcumin, die einen vermeintlich guten Chemotherapeutikum für Darmkrebs und Behandlung mit LiCI reduzieren Ausdruck der beiden total Tau und Tau in colorectal Krebs-Zelllinien phosphoryliert. Diese Behandlungen verursachen auch nukleare Translokation von Tau. Jedoch nicht unerwartet, Curcumin, Bindung von Tau zu Mikrotubuli zu verbessern.

Protocol

1. Vorbereitung der Reagenzien fügen Sie 10 µL (1 mM) Phenylmethylsulfonyl Fluorid Lösung, 10 µL Protease-Inhibitor-cocktail-Lösung (1 X 100 X lagermäßig) und 10 µL (1 X 100 X lagermäßig) Phosphatase Inhibitor cocktail Lösung 1 mL 1 X radioimmunoprecipitation (RIPA) Testpuffer komplette RIPA Lyse Puffer vorzubereiten. Vorbereitung 10 x allgemeine Tubulin Puffer (PEM) Puffer. Add 800 mM (6,0474 g) Piperazin-N-N ' – Bis – 2-Ethanesulfonic Säure, 10 mM (95,1 mg)…

Representative Results

Ausdruck der gesamten Tau und Phospho-Tau wurde geprüft, nach der Behandlung der Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Curcumin oder LiCI (Abbildung 1). Behandlung der Zellen mit den drei verschiedenen Konzentrationen von Curcumin verringerte Tau Ausdruck; Phospho-Tau Ausdruck erhöht bei der Behandlung mit geringen Konzentration von Curcumin jedoch verringerte sich auf Behandlung von Zellen mit höheren Konzentrationen von Curcumin. Anti-Phospho-Tau …

Discussion

Dieses Manuskript verschiedenen verfahrensrechtliche Voraussetzungen für die Erkennung von insgesamt Tau etabliert und phosphoryliert Tau in colorectal Krebszellen mit Curcumin und LiCI behandelt. Um den Gesamtstatus der Phosphorylierung des Tau in Proteinproben zu beurteilen, wurde eine Phosphatase-Assay beschrieben. Dieser Assay kann möglicherweise verwendet werden, um den Status der Phosphorylierung von jedem Protein untersuchen.

Dieser Test basiert auf dem Prinzip, die Protein bewegt sic…

Materials

HCT 116 cell	ATCC	CCL-247
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Store at -20 °C
penicillin-streptomycin	Hyclone	SV30010
Trypsin-EDTA solution	WelGene	LS 015-01
100 mm dish	Corning	430161
6 well plate	Corning	Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody	abcam	ab19030
Dithiothreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T1912	Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)	Cytoskeleton	MT001	Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide	Sigma	72068
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M2670
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Store at -20 °C
DPBS	WelGene	LB 001-02
Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	Model 500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
PIPES	Sigma	P1851
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906
Molecular Imager	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Store at 4 °C
Protein assay dye reagent	Bio-Rad	500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb	Cell signalling	2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signalling	2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody	abcam	ab109390
EGTA	Sigma	E3889	Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase	Thermo Scientific	EF0651	Store at -20 °C
PMSF	Sigma	P7626	Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Cell Signalling	5870	Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail	Cell Signalling	5871	Store at 4 °C
RIPA Buffer	Sigma	R 0278	Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human	Sigma	T 9950	Store at -20 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X – 100	Store at around 25 °C
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11005	Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy	Leica Microsystem	Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Affymetrix	75819
Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Store at 4 °C