Forbedre anvendelsen av høy molekylvekt Biotinylated dekstran Amin for Thalamocortical projeksjon sporing i rotte
Summary
Her presenterer vi en raffinert protokoll for å effektivt avsløre biotinylated dekstran Amin (BDA) merking med et fluorescerende flekker metoden ved hjelp av en gjensidig nevrale sti. Det er egnet for analyse av fine strukturen av BDA merking og skille den fra andre nevrale elementer under en AC confocal laserskanning mikroskop.
Abstract
Høy molekylvekt biotinylated dekstran Amin (BDA) har blitt brukt som en svært følsom nevroanatomi tracer i mange tiår. Siden kvaliteten på sin merking ble påvirket av ulike faktorer, her gir vi en raffinert protokoll for anvendelse av høy molekylvekt BDA for å studere optimal nevrale merking i sentralnervesystemet. Etter stereotactic injeksjon av BDA i ventrale posteromedial kjernen (VPM) i thalamus med rotta gjennom en delikat glass pipette, var BDA farget med fluorescerende streptavidin-Alexa (AF) 594 og counterstained med fluorescerende Nissl flekk AF500/525. På bakgrunn av grønne Nissl flekker, ble den røde BDA merking, inkludert neuronal cellen legemer og axonal terminaler, mer tydelig demonstrert i somatosensory cortex. Videre doble fluorescerende flekker for BDA og kalsium-bindende protein parvalbumin (PV) ble utført for å observere korrelasjon av BDA merking og PV-positive interneurons i kortikale målet, gir mulighet til å studere lokalt nevrale kretser og deres kjemiske egenskaper. Dermed dette raffinert metoden er ikke bare egnet for å visualisere høykvalitets nevrale merking med høy molekylvekt BDA gjennom gjensidige nervebaner mellom thalamus og hjernebarken, men også tillater samtidig demonstrasjon av andre nevrale markører med fluorescerende histochemistry eller immunochemistry.
Introduction
Høy molekylvekt BDA (10.000 molekylvekt), en svært følsom tracer, har blitt brukt for å spore nervebaner i sentralnervesystemet for over 20 år1. Selv om bruken av BDA er en vanlig nevrale traktat sporing teknikk, kan kvaliteten på BDA merking påvirkes i dyr av ulike faktorer1,2,3. Våre siste studie viste at den optimale strukturen av BDA merking er ikke bare forbundet med riktig etter injeksjon overlevelse tid, men også korrelert med flekker metode4. Inntil nå, konvensjonelle avidin-biotin-peroxidase kompleks (ABC), streptavidin-fluorescein isothiocyanate og streptavidin-AF594 ble flekker metodene brukt for å avsløre BDA merkingen i tidligere studier2,3, 4,5. Sammenligning kan fluorescerende flekker for BDA enkelt utføres.
For å utvide bruken av høy molekylvekt BDA, ble en raffinert protokoll introdusert i studien. Etter injeksjon av BDA i VPM i thalamus med rotte hjernen ble BDA merking avslørt den vanlige metoden for standard ABC flekker og dobbel fluorescerende flekker, som ble gjennomført for å observere korrelasjon av BDA merking og grunnleggende nevrale elementer eller interneurons i kortikale målet med streptavidin-AF594 og fluorescerende Nissl histochemistry eller PV-immunochemistry, henholdsvis. Gjennom de gjensidige nervebaner mellom VPM og den primære somatosensory cortex (S1)6,7,8fokuserer vi vår observasjon på BDA merking i thalamocortical anslått axons og corticothalamic anslått celle somas i S1. Ved denne prosessen forventet vi å gir ikke bare en detaljert protokoll for å få den høye kvaliteten på neural merking med høy molekylvekt BDA, men også en raffinert protokoll på kombinasjonen av fluorescerende BDA merking og andre fluorescerende nevrale markører med Histochemistry eller immunochemistry. Denne tilnærmingen er å foretrekke å studere lokal nevrale kretser og deres kjemiske egenskaper under en AC confocal mikroskopi for laserskanning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Velge en riktig tracer er et kritisk punkt for en vellykket nevrale sporing eksperiment. I familien av BDA, høy molekylvekt BDA (10.000 molekylvekt) ble anbefalt transporteres fortrinnsvis gjennom anterograd nevrale sti i motsetning til lav molekylvekt BDA (3000 molekylvekt)2,3 , 11 , 12 , 13. imidlertid mange studier også antydet at høy molekylvekt BDA kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (Project kode nr. 81373557, nr. 81403327).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O’Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
