Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek
Summary
Burada, etkili bir floresan yöntemi aracılığıyla karşılıklı bir sinirsel yol boyama ile etiketleme biotinylated dextran Amin (BDA) ortaya çıkarmak için rafine bir iletişim kuralı mevcut. Bu güzel yapı çözümleniyor için uygundur, etiketleme ve confocal bir lazer tarama mikroskop altında sinirsel diğer öğelerinden ayırt BDA.
Abstract
Yüksek molekül ağırlıklı biotinylated dextran Amin (BDA) son derece hassas bir nöroanatomik izleyici onlarca yıl için kullanılmıştır. Onun etiketleme kalitesini çeşitli etkenlere göre burada, etkilendi biz rafine bir protokol yüksek molekül ağırlıklı BDA uygulama için en uygun sinir merkezi sinir sistemi etiketleme çalışmak için sağlar. BDA farenin hassas cam pipet ile talamus ventral posteromedial çekirdeği (VPM) içine stereotaksik enjeksiyon sonra BDA floresan streptavidin ile-Alexa (AF) 594 lekeli ve floresan Nisl leke AF500/525 ile counterstained. Yeşil Nisl boyama arka plan üzerinde kırmızı BDA, nöronal hücre gövdeleri ve aksonal terminaller gibi etiketleme daha belirgin korteks somatosensor gösterilmiştir. Ayrıca, floresan BDA için boyama çift ve kalsiyum bağlayıcı protein parvalbumin (PV) korelasyon BDA etiketleme ve PV-pozitif interneurons sinirsel yerel çalışma fırsatı sağlayan kortikal hedefteki gözlemlemek için yapılmıştır Devreler ve kimyasal özellikleri. Böylece, rafine bu yöntem sadece yüksek kaliteli talamus ve serebral korteks arasında karşılıklı Sinirsel yollar aracılığıyla yüksek molekül ağırlıklı BDA ile etiketleme sinirsel görüntülenmesi için uygun değildir, ancak aynı zamanda eşzamanlı gösteri verecektir Floresan histochemistry veya İmmünokimya diğer sinir işaretleyicilerle.
Introduction
Yüksek molekül ağırlıklı BDA (10.000 moleküler ağırlık), son derece hassas bir izleyici, merkezi sinir sistemi üzerinde 20 yıl1için Sinirsel yollar izleme için kullanılmıştır. BDA kullanımı teknik izleme ortak bir sinir yolu olsa da, BDA etiketleme kalitesini hayvanlarda çeşitli faktörler1,2,3tarafından etkilenebilir. Bizim son çalışma BDA etiketleme en uygun yapısı sadece uygun sonrası enjeksiyon yaşam süresi ile ilgili ama aynı zamanda boyama yöntemi4ile korelasyon göstermiştir. Şimdi, geleneksel avidin-biotin-peroksidaz kompleksi (ABC), streptavidin floresein isothiocyanate ve streptavidin-AF594 kadar boyama yöntemleri BDA önceki çalışmalar2,3‘ teetiketleme ifşa için kullanılması, 4,5. Buna karşılık, floresan BDA için boyama kolayca gerçekleştirilebilir.
Yüksek molekül ağırlıklı BDA uygulanması genişletmek için rafine bir iletişim kuralı da çalışmanın kullanılmaya başlandı. Talamus sıçan beyin VPM içine BDA enjeksiyonu, BDA etiketleme ortaya standart ABC boyama düzenli yöntemi yanı sıra çift Floresan, hangi BDA etiketleme korelasyon gözlemleyerek için gerçekleştirildiği boyama ve temel Sinirsel öğeleri veya interneurons kortikal hedef streptavidin-AF594 ve floresan Nisl histochemistry veya PV-İmmünokimya, anılan sıraya göre. VPM ve Primer somatosensor korteks (S1)6,7,8arasında karşılıklı Sinirsel yollar, biz bizim gözlem BDA etiketleme öngörülen thalamocortical akson ve corticothalamic üzerinde duruldu S1 içinde öngörülen hücre somas. Bu işlem tarafından sadece sinirsel yüksek molekül ağırlıklı BDA ile etiketleme yüksek kalitesini elde etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı, aynı zamanda rafine bir protokol floresan BDA etiketleme ile birlikte ve diğer floresan sinirsel belirteçleri ile sağlamak bekleniyor histochemistry veya İmmünokimya. Bu yaklaşım yerel sinir devreleri ve confocal bir lazer mikroskobu tarama altında kimyasal özellikleri çalışma için tercih edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uygun izleme aygıtı seçme başarılı sinirsel izleme deneme için kritik bir adımdır. BDA, yüksek molekül ağırlıklı BDA ailesi (10.000 moleküler ağırlık) düşük moleküler ağırlıklı BDA (3.000 moleküler ağırlık)2,3 aksine anterograd sinir yolu ile tercihen taşınması için tavsiye edilir , 11 , 12 , 13. ancak, birçok çalışma Ayr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından (proje kod No 81373557; No 81403327) finanse edildi.
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O’Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
