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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

에이 Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

여기에서 우리는 구리 혐오 행동의 변화와 일반적인 음식 공급원을 찾아내는 능력을 평가하기 위해 고안된 Caenorhabditis elegans 특이 적 검정법을 제시합니다. 유기체가 잘 먹는 것에서 굶주린 영양 상태로 진행되기 때문입니다.

Abstract

생존을 보장하기 위해 유기체는 일관성없는 식량 원천을 확보하면서 부적절한 서식지를 피할 수 있어야합니다. Caenorhabditis elegans 는 다양한 환경 적 자극을 감지하면 운동 패턴을 변경하고 기아 상태에 반응하여 행동 반응을 조절할 수 있습니다. 선충류는 일반적으로 30 분 이상 식량 공급원에서 제거되면 감소 된 혐오 반응을 보입니다. 변화하는 영양 상태에 대한 행동 변화의 관찰은 잘 먹는 상태에서 굶주린 상태로의 전환을 규제하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

우리는 혐오 장벽 ( 예 : 구리)을 통과하여 장기간에 걸쳐 음식물에 도달하는 선충류의 능력을 측정하는 분석법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이전의 작업을 바탕으로, 유기체가 a로 이동함에 따라 계속적인 데이터 수집을 허용하는 방식으로 여러 변수를 통합합니다.점점 더 굶주린 상태. 더욱이,이 분석은 선충의 더 큰 집단이 동시에 평가 될 수 있도록 증가 된 표본 크기를 허용한다.

구리를 감지하거나 반응하는 능력에 결함이있는 생물체는 즉시 화학 장벽을 가로 지르는 반면, 야생형 선충은 초기에 쫓겨납니다. 야생형 벌레는 점점 더 굶어 죽어 가면서 장벽을 넘어 식량 공급원에 도달하기 시작합니다. 우리는 식품 감각이나 혐오 화학 물질 검출 등 다양한 환경 신호에 반응 할 수없는 돌연변이 체를 평가하기 위해이 분석법을 고안했습니다. 이 프로토콜을 통해 평가할 때, 결함있는 유기체는 즉시 장벽을 넘었지만 식량 원천을 탐지 할 수 없었습니다. 따라서 이러한 돌연변이 체는 일시적으로 식품 공급원에 도달 함에도 불구하고 화학 장벽을 반복적으로 교차합니다. 이 분석은 혐오감과 기아와 관련된 잠재적 인 경로 결함을 평가하기 위해 웜 집단을 직접 테스트 할 수 있습니다.

Introduction

Caenorhabditis elegans 는 단지 302 개의 뉴런으로 구성된 신경계의 회로 분석이 상대적으로 용이하기 때문에 수십 년 동안 신경 생물학 연구의 모델로 사용되었습니다 1 . 유기체가 환경 신호에 반응하는 것에 의존한다면, 신경계의 대부분은 환경 신호의 통합을 규제하는 데 전념합니다 2 . 신경계의 단순함에도 불구하고 C. elegans 는 방수제 3 , 유인물 4 , 온도 5 , 습도 6 등 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 대응할 수 있습니다. 제대로 환경 신호를 통합하는 실패는 포유 동물 모델 시스템 7-9에서 행동 장애 및 신경 퇴행성 조건의 번호로 연결되어 있습니다. 이용 가능한 다양한 신경 질환 모델 C. elegans의 10 개 및 선충류 약제 스크린 11 의 개발과 관련하여이 미생물은 신경 생물학 연구에 유용한 시스템으로 입증되었습니다. 선충류 게놈 12 의 거의 모든 유전자에 매핑 된 선충 인 connectome 1 과 돌연변이의 이용 가능성을 감안할 때, 선충류 신경계에 대한 우리의 이해와 우리 자신의 확장은 창조적으로 적절한 분석법의 디자인에 의해 부분적으로 제한됩니다.

다양한 혐오 자극 3 , 4 , 13 , 14 , 15에 대한 선충 반응성을 평가하기 위해 지난 40 년간 여러 chemotaxis 분석법이 개발되었습니다. 초기 실험은 단일 한 벌레가 한천 판에 배회하는 동안 급성 환경 자극의 도입과 관련되었다= "xref"> 3 , 14 , 16 . 기관지 반응에 대한 즉각적인 변화가 기록되었다. 예를 들어, 휘발성 냄새 물질 인 옥탄 올은 모발에 적용되어 선충의 코 앞에서 떠돌며 야생형 벌레 17 에서 역방향 이동의 시작을 자극 할 수 있습니다. 더 복잡한 분석은 행동의 선택 (18)을 평가하는 수단으로 여러 변수를 포함하도록 개발되어왔다. 이 분석의 변형은 혐오 정중선 배리어 (4)를 제작하는 구리 용액의 사용을 수반한다. 유인물, 즉 디아 세틸은 디아 세틸 공급원으로부터 멀리 이동 된 벌레가있는 화학 장벽의 한쪽면에 놓였습니다. 구리 혐오 반응에 결함이있는 웜은 diacetyl에 도달하는 장벽을 즉시 넘어 섰고 야생 타입 웜은 장벽에 의해 처음에 격퇴되었습니다. 웜이 처음으로 구리 장벽에 접근했을 때 응답이 득점되었습니다.장기간의 관찰없이

굶주림 상태를 겪은 후에 웜을 평가하면 환경 자극에 대한 민감도가 감소합니다 19 . 혐오 화학 옥탄 올이 선충류 앞에서 떠돌 았을 때, 야생형 유기체는 음식에있을 때 3-5 초 내에 거꾸로 움직임을 자극합니다. 10 초 20 -이 생물은 10 분 동안 음식에서 제거 된 후, 그들은 8의 지연 응답을 나타낸다. 따라서 굶주림이 증가하면 선충류는 생존을 위해 음식을 찾는 것이 필수적이 될 때 해로운 환경 신호에 대한 회피 반응이 감소하는 결과를 낳습니다. 반대로, 과도하게 표현 신경 펩티드 수용체 9 (NPR-9), 또는 음식 떨어져 옥탄 올과 혐오 자극 (21)의 수에 대응하는 무능력을 전시에 반응하지 않는 것이 선충. 이 npr-9 (GF) 미생물은 식품 존재시 반전 빈도를 조절하지 않지만들이 거꾸로 운동 (21)의 능력이 강한 것을 나타내는 터치 자극에 응답하여 역방향. 우리는 또한 NPR-9 (LF) 돌연변이들이 음식 (21)의 존재에 자신의 행동을 조절할 수 아직 음식 떨어져 비정상적으로 감소 반전 주파수를 전시 주어진 평가했다. 웜의 영양 상태를 급성 외부 자극의 도입과 결합 시키면 음식 관련 경로가 감각 신호 전달 경로를 광범위하게 조절할 수있는 기전이 밝혀집니다 22 , 23 . 선충류 환경에서 식품의 존재는 에탄올 회수 반응을 평가하는 데에도 사용되었습니다 24 . 이 실험에서 웜을 다양한 농도의 에탄올에서 배양 한 다음 한천 플레이트에 놓고 "food-race assay"라고 불리는 음식 패치를 붙였습니다. 식품 패치는 플레이트의 한쪽 가장자리에 놓고 선충은 w음식 소스에서 멀리 떨어진 장소. 에탄올 철수는 웜이 음식물에 도달하는 데 필요한 시간을 측정하여 평가되었습니다.

이 영양 기반 구리 혐오 분석은 시간 경과에 따른 행동 변화를 평가하는 동안 음식과 구리와 같은 추가 환경 변수를 통합하기 위해 식품 경 쟁 분석을 기반으로합니다. 이것은이 일반적으로 C. elegans의 사회 사를 통해 프로토콜을 사용하는 적응이다. 이 프로토콜은 혐오 반응 및 4 시간 동안의 음식 검출을 평가하는 데 사용되었습니다 21 . 음식 박탈 (25)의 30 분 후 웜의 전시 기아 행동 때문에, 우리는 또한 영양 상태에 변화가 환경의 응답에 영향을 미칠 수있는 방법을 평가할 수 있습니다. 이 분석의 조건은 실험 생물체가 시간이 지남에 따라 혐오적인 자극에 대한 반응을 변화시키는 방법을 측정하므로 행동 변화를 다음과 같이 평가합니다.유기체는 굶어 죽은 상태로 나아 간다 (그리고 연장 된 기아의 계속적인 측정). npr-9 (GF) 동물은 음식이나 많은 혐오 단서에 반응하여 행동을 바꾸지 않기 때문에 이러한 행동 적 결손이 기아와 관련하여 지속되는지 확인하려고했습니다. 궁극적으로,이 분석 디자인은 npr-9 (GF) 돌연변이 체를 특이 적으로 평가하기 위해 제형 화되었지만 새로운 균주의 특성을 규명하기 위해 추가로 적용될 수있다.

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Protocol

1. 실험 생물의 제조

  1. 시험 할 때 유기체가 젊은 성인임을 확인하기 위해 분석을 시작하기 24 시간 전에 균주 당 10 L4 단계의 선충을 뽑는다. 시험 된 각 돌연변이 또는 대조구 선충에 대해 10 개의 L4s (대조군의 경우 10 개, 분석의 경우 10 개)를 선택하십시오.
    1. OP50 Escherichia coli로 시딩 된 표준 한천 평판에서 24 시간 동안 표준 방법 26 , 27 을 사용하여 L4 유기체를 유지한다. 후속 세척 단계에서 미생물이 손실되면 시작 샘플 크기를 늘려 보정하십시오 ( 예 : 10 개가 아닌 20 개의 웜을 선택하십시오).
      참고 : 행동은 본질적으로 변이가되는 표현형입니다. 세 가지 별도의 일에 각 변형에 대해 세 번씩 방법을 수행하십시오. 토론 장에서 강조한 바와 같이 추가 균주에 대한 추가 제어 균주 및 조건을 포함시킵니다.
  2. 분석하기 직전에 실험용 orga를 옮깁니다.박테리아가없는 한천 플레이트로 옮겨서 선충류를 1 분 동안 자유롭게 움직여 과도한 박테리아를 제거 할 수 있습니다.
    1. 실험 생물체가 분석 전 24 시간 동안 오염 조건을 경험했다면 폐기하십시오.
  3. 박테리아가없는 플레이트에 M9 1 mL를 넣고 웜을 마이크로 원심 분리 관으로 씻어냅니다.
  4. 3,000 xg에서 1 분간 원심 분리하십시오. 웜은 튜브의 바닥에 펠렛을 형성해야합니다. 웜 펠렛을 방해하지 않고 M9 용액을 흡인하십시오. 벌레 펠렛에 M9 1 mL를 넣고 튜브를 뒤집어 웜을 용액과 섞는다.
  5. 1.4 단계를 세 번 더 반복하십시오.
    1. 과도한 박테리아가 처음에 웜과 함께 옮겨지면 총 5 회 반복하십시오. 박테리아는 구리 식품 레이스 플레이트에 옮겨지지 않아야합니다. 식품이 분석 판에 옮겨지면 정확한 데이터 수집을 방해합니다.
  6. 최종 세척 후 상등액을 10081; L의 M9와 웜 펠렛이 남아있다.
    주의 : 기아와 관련된 행동은 30 분 후에 분명해진다. 따라서 세척 단계가 완료되면 웜을 즉시 용액에서 옮겨야합니다.

2. 분석 플레이트의 준비

  1. 표준 NGM 한천 플레이트를 분석하기 이틀 전에 준비합니다.
    1. 플레이트가 습도가 높은 환경에 보관되는 경우 분석 3 일 전에 한천 플레이트를 만드십시오. 또는, 뚜껑을 3 ~ 6 시간 동안 뚜껑을 제거하여 적절하게 건조시킵니다 (살균 환경에있는 경우).
  2. 두꺼운 영구 마커를 사용하여 바깥 쪽 가장자리를 따라 판 아래쪽에 선을 만들고 다른 선은 중간 선 경계를 형성합니다 ( 그림 1 ). 중앙선 장벽은 판의 각 모서리에서 등거리에 있어야합니다. 정확한 측정을 위해 눈금자를 사용하십시오. 이 라인은 박테리아와 구리 용액을 옮길 때 가이드 역할을합니다. 제공됨구리 용액 전에 대장균 이 옮겨지면이 계통이 지표로 사용됩니다.
  3. 균일 한 잔디를 만들기 위해 구리 배리어의 한쪽에만 50 μL의 OP50 E. coli 를 넣은 시드 플레이트 ( 그림 2 ). 박테리아 농도는 분석을 통해 일관되게 유지되어야합니다. 그러나 경미한 농도 차이에 따라 약간의 변동성이 관찰되었다.
    1. 박테리아가 구리 용액과 접촉하지 않도록 판 밑면의 표시된 선을 사용하십시오. 구리 용액이 플레이트의 모서리를 따라 가고 중간 선의 장벽을 형성하는 경우 구리 용액이 식품 공급원과 접촉하지 않도록 박테리아를 옮깁니다.
  4. 두 번째 플레이트 세트를 표시하고 OP50 E. coli 를 아무 것도 옮기지 않습니다 ( 그림 2 ). 이 플레이트는 음성 대조군을 평가하는 역할을합니다. 이 번호판에는플레이트의 한쪽 절반을 표시하여 초기 이동 원점을 나타냅니다.
  5. 박테리아가 건조한 후 37 ℃에서 밤새 배양하십시오. 37 ° C 배양기 또는 실내로 옮길 때 박테리아 패치가 방해받지 않도록하십시오. 과도한 교란은 음식물의 위치 나 모양을 바꿀 수 있습니다.

3. 화학 주성 분석

  1. 갓 준비 시작하기 전에 0.5 M 구리 (II) 황산 용액을 준비하십시오. 플레이트 당 125 μL의 용액이 사용된다면, 사용 된 분석 플레이트 ( 예 : 5 개의 분석 플레이트, 625 μL)의 수에 따라이 용적을 확대하십시오.
  2. 한천 가장자리에 구리 (II) 황산염 용액 100 μL를 피하여 외부 구리 장벽을 만듭니다. 표시된 밑면이 가이드 역할을해야합니다.
  3. 25μL의 구리 (II) 설페이트 용액을 피펫으로 넣어 정중선 장벽을 만듭니다.
    1. 구리 (II) 설페이트 용액이박테리아 패치와 접촉하지 않습니다. 한천에서 들여 쓰기 / 스크래치로 인해 줄무늬가 이동에 영향을 줄 수 있으므로 점을 찍은 기술을 사용하십시오.
  4. 구리 용액을 판 위에 건조시킵니다. 기간은 플레이트 및 실험실 조건에 따라 다를 수 있습니다. 전송 후 5 분마다 건조 상태를 육안으로 확인하십시오.
    참고 : 구리 용액은 파란 색조를 나타내며 쉽게 식별 할 수 있습니다. 실험실 조직을 사용하여 접시 가장자리 근처의 용액을 가볍게 닦아서 건조 함을 확인하십시오.
  5. 튜브 바닥에서 웜 펠렛 20 μL를 분석 플레이트의 박테리아가없는 반으로 피펫 팅합니다.
    1. 10 벌레가 분석 플레이트로 옮겨 졌는지 확인하십시오. 여분의 웜이 실수로 포함 된 경우 halocarbon 오일을 사용하여 제거하여 박테리아가 플레이트에 추가되지 않도록하십시오. 각 분석은 분석 도중 일정한 수의 선충을 가져야합니다.
      참고 : 너무 적은 수의 웜이 transf 인 경우초기 샘플 크기를 늘리면 세척 및 이동 중에 잠재적 인 손실을 줄일 수 있습니다.
  6. 실험실 조직으로 과량의 M9를 제거하십시오. M9는 황산동 용액과 접촉해서는 안된다.
    주의 :이 단계를 수행하는 동안 웜과 한천 표면이 영향을받지 않도록하십시오. 너무 거칠게 사용하면 실험실 조직이 플레이트의 한천 표면에 움푹 패인 곳을 만들 수 있으며 벌레를 제거 할 수 있습니다. KimWipe 를 통해 우발적으로 제거 된 웜은 폐기해야합니다.
  7. M9 솔루션을 제거하고 모든 웜이 비 액체 운동 패턴을 시작하면 분석 스톱워치를 시작하십시오.
    1. 최적으로, 분 이내에 M9 솔루션을 제거하십시오. 필수 매개 변수는 정현파 이동의 식별입니다. 웜은 다르게 이동합니다. 예를 들어 액체에있을 때 사인 곡선보다는 스 래싱입니다. 실험 오르간 각각에 대해 분석 중지 시계를 시작하십시오.isms는 쓰러 뜨림을 멈 춥니 다.
  8. 30 분마다 분석 플레이트를 확인하십시오.
    1. 박테리아 패치가있는 분석 플레이트의 경우 4 시간 동안 식품 패치에 도달하면 긍정적 인 점수를 얻습니다. 네거티브 컨트롤 플레이트의 경우 장벽을 넘었다면 유기체를 긍정적으로 점수를 매 깁니다.

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Representative Results

우리는 야생형 (N2), npr-9 (tm1652) 및 npr-9 과발현 균주, 즉 npr-9 (GF) (IC836- npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; -1 :: rfp), 기아와 구리 혐오에 대한 반응을 평가했습니다. NPR-9 (GF) 돌연변이는 4 시간 분석 21 위에 구리로 혐오 반응을 시작하지 않지만 야생형 유기체 검출하고 혐오 구리 배리어에 응답 할 수있다. 굶주림 30 분 후에 야생형 (N2) 유기체의 약 50-60 %가 구리 장벽을 넘어 식량 패치에 도달합니다. 2 시간 후 야생형 선충류의 75 %가 식량 공급원에 도달합니다. 분석이 끝날 때까지 100 %의 N2 유기체가 식품 공급원으로 재배치되었습니다. 대조적으로, 대다수의 npr-9 (GF) 유기체는 음식에 반응하여 locomotory pattern을 조절하지 않으며 음식과 접촉 한 후에도 aversive 장벽을 계속 지나칠 것입니다출처. npr-9 (GF) 웜은 4 시간 분석을 통해 식품에 대한 응답으로 자신의 이동을 계속 변경하지 못하며 시험 생물의 30 %만이 주어진 시간에 식품에서 발견됩니다. Npr-9 (LF) 동물은 N2 유기체뿐만 아니라 기아가 음식물에 도달하기까지 증가합니다 ( 그림 3 ). N2 또는 npr-9 (LF) 미생물이 음식없이이 분석을 통해 평가 될 때, 구리 장벽을 거의 건너 지 않습니다. npr-9 (GF) 돌연변이는 장벽을 반복적으로 앞뒤로 반복합니다 ( 그림 4 ).

그림 1
그림 1 : 5cm 페트리 접시의 밑면에 구리 용액 배치를 나타내는 표시의 시각적 표현. 이러한 표시는플레이트의 섹션을 적절히 측정하여 박테리아 패치를 옮기고 구리 용액을 한천 표면에 옮길 때 가이드 라인으로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 5cm 페트리 접시는 온 / 오프 식품 분석 플레이트를위한 두 섹션으로 나누어지고 세균 잔디는 온 - 식품 플레이트에 대한이 섹션 중 하나의 센터에서 형성됩니다. 음식물 찌꺼기는 접시의 모서리를 감싸고 정중선 장벽을 형성하는 시험 화합물과 접촉해서는 안됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<p class = "jove_content"fo : keep-together.within-page = "1"> 그림 3
그림 3 : 영양 상태에 기초한 구리 회귀 분석에 반응하여 4 시간 동안 식품 공급원에 도달하는 N2, npr-9 (tm1652) 및 npr-9 (GF) 웜의 백분율. 데이터 포인트는 두 종류의 균주에 대해 각각 다른 날에 수행 된 최소 세 번의 실험 (n> 30 벌레)의 평균입니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로 제시되고 양방향 반복 측정 ANOVA로 분석됩니다. ** 동일한 조건 하에서 N2 동물과 유의하게 다른 p <0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 4 시간 동안 식품 공급없이 구리 장벽을 가로 지르는 N2, npr-9 (tm1652) 및 npr-9 (GF) W orms의 백분율 . 상기 균주는 음식이 없을 때 구리 혐오에 대해 평가되었다. 양성 반응은 구리 장벽을 넘어 플레이트의 비원 원 반쪽에 남은 것으로 기록됩니다. 데이터 포인트는 두 종류의 균주에 대해 각각 다른 날에 수행 된 최소 세 번의 실험 (n> 30 벌레)의 평균입니다. 데이터는 평균 ± SE로 제시되었고 양방향 반복 측정 ANOVA로 분석 한 세 번의 독립적 인 실험에서 적어도 10 마리의 동물을 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 분석 설계는 선충류의 손실을 방지하는 혐오 중심선과 배리어 판의 가장자리 주위를 제작하는 구리 용액을 포함하는 식품 레이스 분석 24 수정한다. 생물체는 혐오 장벽을 넘어 4 시간 동안 음식물에 도달하는 능력을 테스트합니다. npr-9 (GF) 의 맥락에서, 우리는 기아 조건이 어떻게 혐오 반응과 음식 검출에 영향을 미칠 수 있는지 평가하기 위해이 분석을 활용했습니다. 이전에 npr-9 (GF) 가 음식 및 혐오 단서에 대한 반응성에 결함이있는 것으로 판별 한 경우, 기아가 결함 npr-9 (GF) 거동을 조절할 수 있는지 평가하기 위해 영양 환경과 배수 환경 단서를 결합했습니다. 이 분석은 웜이 화학적 자극과 음식 신호 3 , 4 를 감지하고 이에 반응하는 능력에 의존합니다. 분석 된 다양한 변수를 고려할 때,오염 물질을 제거하기 위해서는 주변 생물을 세 심하게 관리해야합니다. uncharacterized 돌연변이, 즉 알려지지 않은 혐오감이나 음식 반응성이있는 돌연변이 체의 경우 추가 제어 균주를 사용해야합니다. 예를 들어 che-2 또는 odr-3 28 과 같은 악성 결함있는 균주 및 tph-1 29 와 같은 음식물의 이동 패턴을 변경시키지 않는 돌연변이 체도 동 및 기아 상태가 적절하게 조절되도록 평행하게 평가되어야한다. 또한 평가 된 행동에 대한 기아 발생의 기여를보다 직접적으로 강조하기 위해 별도의 분석 조건을 추가 컨트롤을 위해 개발할 수도 있습니다. 예를 들어, 선충은 분석 전에 즉시 굶어 죽을 수있는 상태의 유기체가 구리에 반응하여 음식물에 도달하는 속도를 확인하기 위해 분석 용 접시 (음식 포함)로 옮길 수 있습니다. 우리의 현재의 분석 하이라이트실험적인 유기체가 잘 먹는 상태에서 굶주린 상태로 진행됨에 따라 반응이 큼.

우리의 분석은 더 긴 기간 동안 행동을 평가하기 위해 강한 자극 ( 즉, 높은 농도)이 통합 된 일반적으로 사용되는 C. elegans chemotaxis assay 4 의 변형입니다. 이 분석은 즉각적인 반응을 평가하는 것이 아니라, 혐기 상태로 진행되는 유기체 (필요한 통제가 포함 된 경우)에서 혐오 반응의 변화를 측정하는 데 활용할 수 있습니다. 비슷한 평가가 에탄올 회수 반응을 평가하기 위해 구리가없는 경우에 사용되었는데, 즉 24 시간에 걸쳐 음식을 찾는 선충.

C. elegans의 행동 분석과 마찬가지로 환경 변수를 제어하는 ​​것은 지속적으로 재현 가능한 결과를 보장하는 데 필수적입니다. 생물체는 모두 같은 ag이어야합니다.e, 행동 반응은 연령에 따라 다를 수 있습니다. 더욱이, 웜의 영양 상태의 다양성은 기아 상태에 대한 순응을 변화시킬 수 있습니다. 따라서 실험 웜은이 프로토콜 이전의 어느 시점에서든 기아를 겪지 않아야합니다. 또한 자손의 행동 (30)에 영향을 미칠 수있는 부모 세대의 기아 경험; 따라서 실험 생물체가 최소한 2 세대 동안 잘 먹고 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 또한, 분석 플레이트에 전사 유기체의 수는 지역 인구 밀도가 분산 속도 (31)에 영향을 미칠 수 있음을 특정 일관성을 유지한다. 웜이 플레이트로 옮겨지면 한천 표면에 손상을주지 않으면 서 실험실 조직으로 과량의 M9 용액을 제거하는 것이 중요합니다. 표면으로의 변형은 자발적인 운동 패턴을 방해 할 수 있습니다. 과도한 해결책은 공식적인 시작을 시작하기 전에 적절히 제거해야합니다.쓰러진 행동, 즉 액체에서 관찰되는 선충 기관차 패턴이 존재하지 않도록하기위한 분석. 명확한 지표는 크롤링 동작을 찾는 것입니다.

분석 플레이트는 플레이트와 박테리아 건조가 일치하도록 제어되어야합니다. 지나치게 신선한 판은 운동 결함을 유발할 수 있으며 또한 환경 자극의 탐지를 방해 할 수 있습니다 6 . 구리 용액의 적용은 가능한 한 일관성이 있어야 혐오적인 장벽이 적절하게 두껍고 식품 공급원과 접촉하지 않아야합니다. 구리 용액을 너무 적게 사용하면 야생형 혐오 반응 시간을 단축시킬 수 있고, 너무 많은 경우 선충에게 치명적일 수 있습니다. 구리 용액에 균일 한 두께를 목표로하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 구리 용액을 적용하는 동안 한천에 압흔이 생기면 분석 플레이트를 버려야합니다. 웜은 구멍을 통해 구멍을 뚫을 수 있습니다 32특히 혐오스러운 물질이나 기아에 직면했을 때. 샘플 사이의 플레이트 균일 성을 보장하기 위해 웜 ( 예 : 돌연변이 및 야생형)이 섞여있는 집단 ( 예 : GFP 를 통해 )이 명확하게 분류 된 경우 동일한 플레이트에서 측정 할 수 있습니다.

이 분석은 표준 크기의 한천 플레이트에서 수행되었지만 더 큰 플레이트 ( 예 : 직경 100mm)를 사용할 수 있습니다. 이 시나리오에서 웜 이동에 충분한 시간을 제공하려면 분석 기간을 6 시간으로 연장해야합니다. 큰 접시는 더 큰 인구의 시험을 허용 할 수 있고, 인구 밀도가 장시간 동안 혐오 반응에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는데 사용될 수 있습니다. 보다 기술적으로 진보 된 절차는 이동 가능한 스테이지 33에 결합 된 웜 추적 장비의 사용과 통합 될 수 있습니다. 웜 추적은보다 정확한 측정을 허용하고 추가 변수 ( 예 :

이 분석법은 다른 표현형의 측정을 허용하도록 쉽게 적용될 수 있습니다. 웜의 나이는 나이와 관련된 기아로 인한 혐오적인 변화를 측정 할 수 있도록 다양 할 수 있습니다. 더욱이 실험 웜의 영양 상태에 대한 변화는 식량과 화학 혐오의 맥락에서 굶어 죽는 습관 분석을 가능하게합니다. 프로토콜이 비교 가능한 데이터 세트간에 일관성이있는 한, 실험 생물체의 거의 모든 사전 컨디셔닝은 주 화성 분석을 통해 평가할 수 있습니다.

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Disclosures

우리는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 RGPIN36481-08 William G. Bendena의 지원을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

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References

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신경 생물학 문제 125, chemosensation 구리 기아 혐오 chemotaxis 음식
에이<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 영양 상태 기반 구리 혐오 검정
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Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D.,… More

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

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