In Situ Karakterisatie van Shewanella oneidensis MR1 Biofilms door SALVI en ToF-SIMS

Summary

Dit artikel presenteert een methode voor het kweken van een biofilm voor in situ secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie voor toewijzing van de chemische in haar gehydrateerd staat, ingeschakeld door een microfluidic-reactor, systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm-Interface. De heer Shewanella oneidensis -1 met groene fluorescentie eiwit werd gebruikt als een model.

Abstract

Bacteriële biofilms zijn oppervlak-geassocieerde gemeenschappen die enorm worden bestudeerd om te begrijpen hun zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) en hun rollen in milieu-microbiologie. Deze studie beschrijft een methode om te cultiveren van biofilm gehechtheid aan het systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm Interface (SALVI) en in situ chemische toewijzing van een levende biofilm bereiken door secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie (ToF-SIMS). Dit wordt gedaan via de kweken van bacteriën zowel buiten als binnen het SALVI kanaal met onze gespecialiseerde setup, alsmede via optische beeldvormingstechnieken te detecteren van de aanwezigheid van biofilm en de dikte vóór ToF-SIMS analyse. Onze resultaten tonen aan de karakteristieke pieken van de biofilm Shewanella in zijn natuurlijke staat gehydrateerd, markeren op de gelokaliseerde watermilieu cluster, evenals de EPS-fragmenten, die drastisch afwijken van de dezelfde biofilm gedehydrateerde staat. Deze resultaten tonen aan het vermogen van de doorbraak van SALVI waarmee met een vacuüm gebaseerde chemische imaging instrument voor in situ biofilm imaging.

Introduction

Bacteriële biofilms zijn oppervlak-geassocieerde gemeenschappen die geëvolueerd in de tijd als een verdediging voor bacteriën om te overleven, variërend van ongunstige fysieke en mechanische stimuli, waarin cellen kunnen hechten en overleven in veel mogelijk omgevingen. ^{1 , 2} Biofilms enorm worden onderzocht en hebben toepassingen in vele gebieden zoals biogeneeskunde, biomedische technologie, landbouw, en industrieel onderzoek en ontwikkeling. ^{1 , 2} inzicht in de chemische toewijzing van deze complexe microbiële gemeenschappen, met inbegrip van hun zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) en hun lokale water-clusteromgeving, is van essentieel belang bij het verkrijgen van een nauwkeurige en gedetailleerde voorstelling van hun biologische activiteit. ²

Biofilms bestaan en groeien binnen een sterk gehydrateerd staat. Dit vormt een grote uitdaging in het gebruik van vacuüm gebaseerde oppervlakteanalyse technieken zoals secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie (ToF-SIMS) als gevolg van de moeilijkheid bij het bestuderen van vluchtige vloeistoffen in vacuüm. Dientengevolge, is oppervlakteanalyse vacuüm gebaseerde technieken vrijwel uitsluitend aan biofilm monstes alleen hun gedroogde toestand beperkt gebleven. Echter remt het bestuderen van een biofilm in zijn gedroogde staat het nauwkeurig onderzoek van de echte biologische communicatie. Het veroorzaakt vaak drastische wijzigingen in de EPS-integriteit en biofilm morfologie, die na het vergelijken van droge biofilm massa spectrale resultaten in situ vloeibare studies is aangetoond. ^{3 , 4} dit artikel biedt een oplossing voor het bestuderen van biofilms binnen hun natuurlijke gehydrateerd staat door het gebruik van ons systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm Interface (SALVI),^5,6 een reactor van microfluidic die bevat vloeistof onder haar dunne siliciumnitride (SiN) membraan in een microchannel gemaakt van Polydimethylsiloxaan (PMDS), waardoor directe toegang tot de secundaire ion sonde lichtbundel terwijl nog het handhaven van de structurele integriteit van de vloeibare matrix binnen een vacuüm kamer. ^{7 , 8}

S. oneidensis heer-1 gemuteerd om uit te drukken van groene fluorescentie proteïne (GFP) werd gekozen als een modelorganisme voor deze biofilm procedure illustratie vanwege de metabole veelzijdigheid en gemeenschappelijk gebruik in milieu en toegepaste microbiologie, dat gebaseerd was zwaar op de unieke mogelijkheid voor de vermindering van de metalen en de extracellulaire elektron overdracht. ^{9 , 10 , 11} daarnaast de aanwezigheid van GFP toegestaan voor gemakkelijk continu biofilm-dikte controle door middel van fluorescentie microscopie, met behulp van een fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-filter. Onze vorige studies hebben aangetoond bewijs van deze bacterie ten gunste van gehechtheid aan het venster van de zonde met behulp van in operando fluorescentie imaging voor biofilm groei tot een dikte van maximaal honderd micrometer valt. ^{4 , 12} terwijl deze paper slechts de bevestiging van de aanwezigheid van biofilm door fluorescentie microscopie te bespreken zal, de SALVI compatible met andere optische beeldvorming methoden, zoals Super-resolutie fluorescentie imaging (dat wil zeggen, gestructureerde verlichting microscopie (SIM)⁹) en confocale laser scanning microscopie (CLSM)⁴imaging). Optische beeldvorming kan dienen voor het meten van de dikte van de biofilm, en verkrijgen van een 3D-beeld van de vorm van de biofilm, zoals deze wordt weergegeven, de dikte en zijn gehechtheid aan het venster van de zonde te bevestigen. ⁹ terwijl GFP werd gebruikt in de analyse van de SIMS, S. oneidensis zonder GFP werd gebruikt voor de groeikromme, als deze enige vereiste meting van optische dichtheid en een fluorescerende imaging niet meer vereist. In het algemeen, het verschil tussen het GFP gelabeld en niet-gecodeerde soort(en) in de groeicurve is te verwaarlozen. Bovendien, terwijl dit protocol S. oneidensis heer-1 GFP als een modelorganisme gebruikt voor het beschrijven van de procedure, is deze procedure ontworpen voor elk bacteriële stam die nodig kan zijn voor teelt binnen SALVI. Hoewel, kennis van de bacteriële stam nodig, wellicht bepaalde voorwaarden groei zoals tijd, temperatuur en zuurstof milieu worden gewijzigd voor de spanning van bacteriën worden gebruikt. Voor groeimedium, deze procedure maakt gebruik van “nanowires” gemiddeld, al soja Bouillon (TSB) zonder dextrose, en al soja agar (TSA) zonder dextrose voor kweken. De samenstelling van “nanowires” medium is speciaal geformuleerd voor de groei en voor het toezicht op extensies van het membraan en het periplasma van S. oneidensis , die lijken te nemen van de vorm van kleine draden en de middellange samenstelling geweest gevestigde eerder onderzoek. ^{13 , 14}

Onze vorige protocol betreffende in situ vloeibare ToF-SIMS heeft het voordeel dat SALVI te bieden heeft voor proteïne immobilisatie en gehechtheid aan de zonde, evenals een gedetailleerd protocol op ToF-SIMS analyse en gegevens geïllustreerd. ¹² in plaats van te herhalen gegevens reductie stappen, dit document zal dienen om in plaats daarvan richten op de unieke aanpak van instellen en het cultiveren van biofilms binnen onze microchannel SALVI, evenals de imaging stappen voor het detecteren van de aanwezigheid van biofilm en dikte voorafgaande ToF-SIMS analyse. Terwijl biofilms hebben eerder is beperkt tot alleen gedroogde monsters in de kamer van vacuüm gebaseerde oppervlakte analytische technieken, kan gedetailleerde EPS en biofilm chemische in kaart brengen van levende biofilms nu worden verkregen in situ vanwege deze nieuwe functionaliteit.

Protocol

1. voorbereiding van materialen Voorbereiding van Medium buis Serum flessen (één per biofilm cultuur en drie nodig per groeicurve nodig) Opmerking: zoals vermeld in de inleiding, een groei medium geschikt is om de voedingsstoffen die nodig zijn voor de spanning van bacteriën van belang kan worden gebruikt voor deze procedure; in dit geval " nanowires " media en TSB zonder dextrose medium werd gebruikt voor de groei van S. oneidensis heer-1 GFP. <sup class="xre…

Representative Results

Deze representatieve resultaten dienen om te tonen hoe het chemisch profiel van de bijgevoegde biofilm kan worden geïdentificeerd en geïnterpreteerd, verkregen door middel van ToF-SIMS. Na het uitzetten van de massaspectra van ToF-SIMS data-acquisitie, kort gemarkeerd in de sectie procedures moet piek identificatie worden gevoerd om identiteiten aan elke respectieve m/z-waarde toewijzen. Dit kan gebeuren door middel van uitgebreide literatuurstudie over Spectrometrie van de massa op bac…

Discussion

Na het enten in log-fase, is het belangrijk om te testen het aantal dagen en temperatuur waartegen de biofilm groeien moet voordat het is gezond en dik genoeg voor beeldvorming, zoals beschreven in stap 3.1. Deze procedure specifiek betrekking heeft op het kweken van een S. oneidensis MR1 biofilm bij kamertemperatuur; verschillende kamer temperaturen kunnen echter het tempo van de groei beïnvloeden. Daarom is het cruciaal voor optische imaging gebruiken om te begrijpen of de biofilm klaar voordat u verdergaat naar de To…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}