In Situ Karakterisering av Shewanella oneidensis MR1 biofilm SALVI og ToF-SIMS

Summary

Denne artikkelen presenterer en metode for å dyrke en biofilm for i situ tid-av-flight sekundære ion massespektrometri for kjemiske tilordning i hydrert tilstand, aktiveres av en microfluidic reaktoren, System for analyse på flytende vakuum grensesnittet. Den Shewanella oneidensis MR-1 med grønne fluorescens protein ble brukt som modell.

Abstract

Bakteriell biofilm er overflaten-assosiert samfunn som er vesentlig undersøkt for å forstå deres egenproduserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres roller i miljømessige mikrobiologi. Denne studien skisserer en metode for å dyrke biofilm vedlegg til systemet for analyse på flytende vakuum grensesnitt (SALVI) og oppnå i situ kjemiske tilordning av en levende biofilm ved time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS). Dette gjøres gjennom dyrking av bakterier både utenfor og innenfor SALVI kanalen med våre spesialiserte oppsett, samt gjennom optisk tenkelig teknikker å oppdage biofilm tilstedeværelse og tykkelse før ToF-SIMS analyse. Våre resultater viser karakteristiske topper Shewanella biofilm i naturlig hydrert tilstand utheving på sin lokaliserte vann klyngemiljø, samt EPS fragmenter, som er vesentlig annerledes ut enn den samme biofilm dehydrert staten. Disse resultatene viser gjennombrudd evnen til SALVI som tillater i situ biofilm bildebehandling med et vakuum-baserte kjemiske tenkelig instrument.

Introduction

Bakteriell biofilm er overflaten-assosiert samfunn som har utviklet seg over tid som forsvar for bakterier å overleve varierende ugunstig fysiske og mekanisk stimuli, der celler er kjøpedyktig feste og overleve i mange mulige miljøer. ^{1 , 2} biofilm er vesentlig undersøkt og ha søknader i mange felt som biomedisin, biomedisinsk engineering, landbruk, og industriell forskning og utvikling. ^{1 , 2} forstå kjemiske tilordningen av disse komplekse mikrobielle samfunn, inkludert deres egenproduserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres lokale vann-klyngemiljø, er viktig å få en nøyaktig og detaljert fremstilling av deres biologiske aktiviteter. ²

Biofilm finnes og vokse i svært hydratiserte staten. Dette utgjør en stor utfordring i å bruke vakuum-baserte overflaten analyseteknikker som tid-av-flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS) på grunn av vanskelighetene i å studere flyktig væske i vakuum. Som et resultat, er vakuum-baserte overflaten analyseteknikker begrenset nesten utelukkende til å studere biofilm eksempler på bare deres tørket tilstand. Men hemmer studerer en biofilm i tørket tilstand nøyaktig etterforskningen av sin ekte biologiske microenvironment. Det fører ofte til drastiske endringer EPS integritet og biofilm morfologi, som har vist etter sammenlignende tørr biofilm masse spectral resultater i situ flytende studier. ^{3 , 4} denne artikkelen presenterer en løsning for å studere biofilm i sin naturlige hydrert tilstand ved å ansette bruk av systemet for analyse på flytende vakuum grensesnitt (SALVI),^5,6 microfluidic reaktoren som inneholder væske under sin tynne silicon nitride (synd) membranen i en microchannel laget av polydimethylsiloxane (PMDS), noe som gir direkte tilgang til sekundære ion sonde strålen samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til flytende matrisen i et vakuum kammeret. ^{7 , 8}

S. oneidensis MR-1 mutert for å uttrykke grønne fluorescens protein (GFP) ble valgt som en modell organisme for denne biofilm prosedyren illustrasjonen pga metabolske allsidighet og vanlig bruk i miljø og anvendt mikrobiologi, som var basert tungt på sin unike evne for metall reduksjon og ekstracellulære elektron overføring. ^{9 , 10 , 11} i tillegg tilstedeværelsen av GFP tillatt for enkel kontinuerlig biofilm-tykkelse overvåking gjennom fluorescens mikroskopi, bruke filtere fluorescein isothiocyanate (FITC). Våre tidligere studier har vist bevis av denne bakterien favoriserer vedlegg til vinduet synd med i operando fluorescens imaging for biofilm vekst til en tykkelse på opp til 100 mikrometer. ^{4 , 12} mens dette papiret vil bare diskutere bekreftelse av biofilm’s tilstedeværelse gjennom fluorescens mikroskopi, SALVI er kompatibel med andre optisk tenkelig metoder som Super-oppløsning fluorescens imaging (dvs. strukturert belysning mikroskopi (SIM)⁹) og AC confocal mikroskopi (CLSM) imaging⁴for laserskanning). Optisk imaging kan tjene til å måle biofilm tykkelsen og få et 3D-bilde av formen på biofilm som den vises, bekrefter sin tykkelse og festet til vinduet synd. ⁹ mens GFP ble brukt i SIMS analyse, S. oneidensis uten GFP ble brukt av vekst kurve, som bare kreves målingen av optisk tetthet og ikke krever noen fluorescerende bildebehandling. Vanligvis forskjellen mellom GFP merket og ukodede arter i vekstkurve er ubetydelig. I tillegg, mens denne protokollen bruker S. oneidensis MR-1 GFP som en modell organisme for å beskrive prosedyren, er denne fremgangsmåten utformet for bakteriell belastning som kreves for dyrking i SALVI. Selv gitt kunnskap om bakterielle belastningen nødvendig, må noen vekst forhold som tid, temperatur og oksygen miljø for å imøtekomme stamme av bakterien som skal brukes. For vekst medium bruker denne fremgangsmåten “nanowires” medium, tryptic soya kjøttkraft (TSB) uten druesukker og tryptic soya agar (TSA) uten druesukker for dyrking. Sammensetningen av “nanowires” middels er spesielt utviklet for vekst og overvåking av utvidelser av membranen og periplasm av S. oneidensis som synes å ta form av små ledninger og middels sammensetningen er etablert i tidligere forskning. ^{13 , 14}

Vår forrige protokoll på in situ flytende ToF-SIMS har illustrert fordelen at SALVI har å tilby protein immobilisering og vedlegg til synd, samt en detaljert protokoll på ToF-SIMS strekkodeanalyse og reduksjon. ¹² i stedet for å gjenta data reduksjon trinn, dette papiret vil tjene i stedet fokusere på det unike tilnærmingen til oppsett og dyrke biofilm innenfor våre SALVI microchannel, samt tenkelig trinnene å oppdage biofilm tilstedeværelse og tykkelse tidligere ToF-SIMS analyse. Mens biofilm har tidligere vært begrenset til bare tørket prøver innenfor kammeret av vakuum-baserte overflaten analytiske teknikker, fås nå detaljert EPS og biofilm kjemiske kartlegging av live biofilm i situ på grunn av denne nye funksjonen.

Protocol

1. forberedelse for materiale Forberedelse av middels rør Serum flasker (en nødvendig per biofilm kultur og tre trengs per vekstkurve) Merk: som nevnt i innledningen, noen vekst middels egnet til å gi næringsstoffer som trengs for stamme av bakterien rundt kan utnyttes for denne fremgangsmåten. i dette tilfellet " nanowires " media og TSB uten druesukker mediet ble brukt for veksten av S. oneidensis MR-1 GFP. 13 innskudd 20 m…

Representative Results

Disse representant resultatene tjene til å vise hvordan kjemiske profilen til den tilknyttede biofilm kan identifiseres og tolket, som oppnås gjennom ToF-SIMS. Etter plotting masse spectra fra ToF-SIMS datainnsamling, fremhevet kort i delen prosedyrer bør peak identifikasjon utføres for å tilordne identiteter til hver respektive m/z-verdien. Dette kan gjøres gjennom omfattende gjennomgang på massespektrometri på bakterier og bestemte kjemiske fragmenter som forventes å være til …

Discussion

Etter vaksinere på Logg-fase, er det viktig å teste antall dager og temperaturen der biofilm skal vokse før det er sunn og tykk nok for bildebehandling, som beskrevet i trinn 3.1. Denne fremgangsmåten inneholder dyrking en S. oneidensis MR1 biofilm ved romtemperatur; men forskjellige romtemperatur kan påvirke hastigheten av vekst. Derfor er det viktig å bruke optisk tenkelig for å forstå om biofilm er klar før du fortsetter til ToF-SIMS analyse. Tilsvarende krever annen bakteriestammer ulike vekst forhold og len…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}