Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming
Summary
Her, ble kraften av en transposon-mediert tilfeldige innsetting av en ikke-koding DNA-element brukt til å løse optimale chromosomal plasseringen.
Abstract
Den optimale chromosomal stillingen(e) over et gitt DNA element var/ble fastsatt av transposon-mediert tilfeldige innsetting etterfulgt av fitness utvalg. I bakterier, kan virkningen av genetisk sammenheng på funksjon av en genetisk element være vanskelig å vurdere. Flere mekanismer, inkludert topologisk, transcriptional forstyrrelser fra nærliggende gener, og/eller replication-assosiert genet dosering, kan påvirke funksjonen til et gitt genetisk element. Her beskriver vi en metode som tillater tilfeldig integrering av en DNA-element i kromosomet Escherichia coli og velg de mest gunstige lokasjonene ved hjelp av en enkel vekst konkurranse eksperimentere. Metoden utnytter en godt beskrevet transposon-basert system for tilfeldige innsetting, kombinert med et utvalg av de fittest clone(s) av vekst fordel, en prosedyre som lett justerbar eksperimentelle behov. Naturen av de fittest clone(s) kan bestemmes av hele-genome sekvensering på komplekse multi klonal innbyggere eller enkel genet gå i rask identifikasjon av valgte kloner. Her, ble ikke-koding DNA regionen DARS2, som kontrollerer initiering av kromosom replikasjon i E. coli, brukt som et eksempel. Funksjonen for DARS2 er kjent for replikering-assosiert genet dosering; den nærmere DARS2 får opprinnelsen til utryddelse, jo mer aktiv blir. DARS2 var tilfeldig inn kromosomet av en DARS2-slettet belastning. De resulterende Klonene som inneholder personlige innsettinger var samlet og konkurrerte mot hverandre i hundrevis av generasjoner. Endelig var fittest kloner preget og inneholdt DARS2 i nærheten av den opprinnelige DARS2 plasseringen.
Introduction
Funksjonen av genetiske elementer kan påvirkes av beliggenheten i genomet. I bakterier skyldes dette hovedsakelig forstyrrelser av transkripsjon av nærliggende gener, lokale DNA topologien eller replication-assosiert genet dosering. Spesielt prosessene av utryddelse og segregering er kontrollert, minst i delen, av ikke-koding chromosomal regioner1og den riktige funksjonen av disse regionene avhenger på genomisk plassering/kontekst. I E.coli, eksempler er dif området, kreves for søster kromosom løsning2; KOPS sekvenser, kreves for kromosom segregering3; og datA, DARS1og DARS2 områder, nødvendig for riktig chromosomal replikering kontroll (nedenfor; 4). presenterer vi en metode som tillater for tilfeldig flytting, utvalg og bestemmelse av den optimale genetiske konteksten av enhver genetisk element, eksemplifisert her ved studiet av DARS2 ikke-koding regionen.
E. coli, DnaA er initiativtaker protein ansvarlig for DNA strand åpning på én replikering opprinnelseoriCog rekruttering av helicase DnaB5,6,7. DnaA tilhører AAA+ (dvs. ATPases forbundet med ulike aktiviteter) proteiner og kan binde både ATP og ADP med lignende høy slektskap5. Nivået av DnaAATP topper på innvielsen8, der DnaAATP danner en multimer på oriC som utløser DNA dobbeltsidig åpning9. Etter innvielsen, oriC er gjort utilgjengelig for ny innvielse på grunn av lagring av en mekanisme som involverer binding av SeqA protein til hemimethylated oriC10,11. Under lagring, nivået av DnaAATP er redusert med minst to mekanismer: den regulatoriske inaktivering av DnaA (RIDA)12,13 og datA-avhengige DnaAATP hydrolyse (DDAH)14 ,15. Både RIDA og DDAH fremme konvertering av DnaAATP til DnaAADP. Før en ny runde av innvielsen, DnaAADP aktiveres på nytt til DnaAATP på bestemte DnaA-reaktivere sekvenser (DARS): DARS1 og DARS216,17. Chromosomal datA, DARS1, ogDARS2 er ikke-koding og opptre på en Anstandsdame-lignende måte å modulere DnaAATP/DnaAADP interconversion. Disse regionene, utenfor opprinnelsen til replikering aktiverer montering av en DnaA kompleks for inaktivering (datA, 14) eller Aktivisering (DARS1 og DARS2, 17) av DnaA. Slette DARS2 i en celle, endrer ikke masse dobling tid men resultater i asynkron replikering innvielsen15,16,18. Men DARS2-mangelfull celler har en fitness kostnader i forhold til en ellers isogenic wildtype under både kontinuerlig vekst konkurranse i rike medium eller under etableringen av kolonisering i musen tarmen18. Dette betyr at selv små endringer i asynchrony/opprinnelse konsentrasjon har en negativ effekt på bakteriell fitness. I E. colier en selektiv press for å opprettholde kromosom symmetri (dvs. to nesten like lange replikering armer)19. Dataene, DARS1og DARS2 regioner har samme relative avstanden til oriC i alle E. coli stammer sekvensert18, til tross for store variasjoner i kromosom størrelse.
Her bruker vi DARS2 regionen av E. coli som et eksempel for identifikasjon av chromosomal stillingen(e) optimalt for sin funksjon. DARS2 ble satt inn i den NKBOR transposon, og den resulterende NKBOR::DARS2 transposon deretter inn tilfeldig genomet av MG1655 ΔDARS2. Vi dermed generert en samling celler, hver besittelse DARS2 plassert et annet sted på kromosomet. Et i vitro konkurranse eksperiment der alle cellene i samlingen var samlet og konkurrerte mot hverandre kontinuerlig vekst i LB i en estimert 700 generasjoner, ble utført. Utfallet av konkurransen eksperimentet ble overvåket/bestemt sørlige blot, enkel genet gå og hele-genome sekvensering (WGS; Figur 1). End-Point kloner løses ved enkel genet gå var preget av flowcytometri å vurdere celle syklus parametere. I et flow cytometric analyse, kan Cellestørrelse, DNA innhold og initiering synkronisering måles for et stort antall celler. Under flowcytometri, en strøm av enkeltceller passerer en lysstråle med riktige bølgelengden å opphisse farget DNA, som er deretter samtidig registrert av photomultipliers som samler den slippes ut fluorescensen, et mål på DNA innhold, forutsatt at celler er farget for DNA. Fremover-spredt lyset er et mål på cellen masse20.
I vitro konkurranse eksperimentet vi presenterer her brukes til å løse spørsmål knyttet til betydningen av chromosomal posisjon og genomisk sammenheng med genetisk elementet. Metoden er upartisk og brukervennlig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som er brukt her utnytter state-of-the-art teknikker for å svare på en vanskelig spørsmål angående den optimale genomisk posisjonen av en genetisk element. Tilfeldige innsetting av genetisk elementet (formidlet av transposon) muliggjør rask og enkel innsamling av kloner, som deretter kan gjøres å konkurrere mot hverandre til å velge for den optimale posisjonen undersøkte genetisk elementet (dvs. fittest klone).
Her DARS2 ble satt inn i mini-Tn10-ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne var finansiert gjennom tilskudd fra Novo Nordisk grunnlaget, Lundbeck grunnlaget og danske National Research Foundation (DNRF120) gjennom Center for bakteriell Stress og utholdenhet (BASP.net).
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA Replication, Second Edition. , (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D’Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
