Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones
Summary
Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.
Abstract
La posición o posiciones cromosómica óptima de un determinado elemento de ADN fue/fueron determinada por la inserción al azar mediada por transposones, seguido por la selección de fitness. En bacterias, el impacto del contexto genético de la función de un elemento genético puede ser difícil de evaluar. Varios mecanismos, incluyendo efectos topológicos, interferencia transcripcional de genes vecinos, o dosis de gen asociado de replicación, pueden afectar la función de un elemento genético. Aquí, describimos un método que permite la integración al azar de un elemento de DNA en el cromosoma de Escherichia coli y seleccionar las ubicaciones más favorables mediante una competencia de crecimiento simple experimentan. El método aprovecha de un bien-descrito transposones-sistema de inserción al azar, juntada con una selección de los más aptos clone(s) ventaja del crecimiento, un procedimiento que es fácilmente ajustable a las necesidades experimentales. Puede determinarse la naturaleza de la clone(s) más aptos por todo el genoma que ordenaba en una población clonal múltiples compleja o por gene fácil para la identificación rápida de clones seleccionados. Aquí, la región no codificante de ADN DARS2, que controla la iniciación de la replicación del cromosoma de e. coli, fue utilizada como ejemplo. La función de DARS2 es conocida por ser afectados por dosis de gen asociado de replicación; el más DARS2 obtiene el origen de replicación del ADN, más activo se convierte. DARS2 fue insertado al azar en el cromosoma de un DARS2-elimina la tensión. Los clones resultantes que contienen inserciones individuales se agruparon y compitieron entre sí a cientos de generaciones. Finalmente, los clones más aptos se caracteriza y contiene DARS2 en proximidad cercana a la ubicación original de DARS2 .
Introduction
La función de cualquier elemento genético puede verse afectada por su localización en el genoma. En las bacterias, esto resulta fundamentalmente de interferencia por la transcripción de genes vecinos, local topología de ADN o dosis de gen asociado de replicación. En particular, los procesos de replicación del DNA y la segregación son controlados, al menos en parte, por las regiones cromosómicas no codificante1y el funcionamiento de estas regiones depende de situación/contexto genómico. En e. coli, los ejemplos son el sitio de dif , necesario para la hermana de resolución del cromosoma2; Secuencias KOPS, necesarias para de la segregación del cromosoma3; datos, DARS1y DARS2 regiones, requeridas para el control de la replicación cromosómica adecuada (abajo; 4). se presenta un método que permite la reubicación al azar, la selección y la determinación del contexto genético óptimo de cualquier elemento genético, ejemplificados aquí por el estudio de la región no codificante de DARS2 .
En e. coli, DnaA es la proteína del iniciador responsable de filamento de la DNA en la replicación solo origenoriCy para la contratación de la helicasa DnaB5,6,7. DnaA pertenece a la AAA+ (es decir, asociados a diversas actividades de ATPasas) proteínas y puede enlazar ATP y ADP con similar alta afinidad5. El nivel de DnaAATP picos en iniciación8, donde DnaAATP forma un multimer en oriC que activa el ADN dúplex apertura9. Después de la iniciación, oriC se hace disponible para la iniciación debido a secuestro por un mecanismo que implica el atascamiento de la proteína SeqA hemimethylated oriC10,11. Durante el secuestro, se reduce el nivel de DnaAATP por al menos dos mecanismos: la regulación inactivación de DnaA (RIDA)12,13 y datos-DnaA dependienteATP hidrólisis (DDAH)14 ,15. RIDA y DDAH promoción la conversión de DnaAATP aADPde DnaA. Antes de una nueva ronda de iniciación, DnaAADP se reactiva a DnaAATP en secuencias específicas de reactivación de DnaA (DARS): DARS1 y DARS216,17. La cromosómica datos, DARS1y DARS2 regiones son no codificante y actuar de una manera como acompañante para modular DnaAATPADP interconversión de /DnaA. Estas regiones, las afueras del origen de replicación, que al montaje de un complejo de DnaA para cualquiera la inactivación (datos; 14) o activación (DARS1 y DARS2; 17) de DnaA. Eliminación de DARS2 en una celda no altera masa doblar tiempo pero resulta en replicación asincrónica iniciación15,16,18. Sin embargo, DARS2-células deficientes tienen un gimnasio costo comparado con un tipo de salvaje lo contrario isogénicas durante ambos competencia de continuo crecimiento en medio rico o en el establecimiento de la colonización en el intestino de ratón18. Esto indica que incluso pequeños cambios en la concentración de asincronía/origen tienen un efecto negativo en fitness bacteriano. En e. coli, hay una presión selectiva para mantener la simetría (es decir, dos brazos de la replicación de casi igual longitud) de cromosoma19. Los datos, DARS1y DARS2 regiones tienen la misma distancia relativa a oriC en todo e. coli cepas secuenciadas18, a pesar de grandes variaciones en el tamaño del cromosoma.
Aquí, utilizamos la región DARS2 de e. coli como ejemplo para la identificación de los puestos cromosómicas óptimos para su función. DARS2 fue insertado en el transposon NKBOR y la resultante NKBOR:: transposonDARS2 posteriormente se inserta al azar en el genoma de MG1655 ΔDARS2. Así generó una colección de células, cada posesión DARS2 colocado en un lugar diferente en el cromosoma. Se realizó un en vitro competencia experimento, donde todas las células de la colección fueron agrupadas y compitieron entre sí durante el crecimiento continuo en libras para un estimado generaciones 700. El resultado del experimento de competencia monitoreados/determinó mediante Southern blot, gene fácil caminar y secuenciación del genoma completo (gt; Figura 1). Clones de punto final resueltas por gene fácil caminar se caracterizaron por citometría de flujo para evaluar los parámetros de ciclo celular. En un análisis cytometric del flujo, tamaño de celda, el contenido de ADN y sincronía de iniciación se pueden medir para un gran número de células. En citometría de flujo, un flujo de células pasa un haz de luz de la longitud de onda adecuada para excitar el ADN teñido, que entonces está simultáneamente registrado por photomultipliers que recogen la fluorescencia emitida, una medida de contenido de ADN, siempre la las células se tiñen para ADN. La luz dispersada hacia adelante es una medida de masa celular20.
El experimento de competencia en vitro que presentamos aquí se utiliza para abordar las cuestiones relativas a la importancia de la posición cromosómica y el contexto genómico del elemento genético. El método es fácil de usar e imparcial.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodología utilizada aquí toma ventaja de las técnicas de vanguardia para responder a una pregunta difícil con respecto a la posición óptima de genomic de un elemento genético. La inserción al azar del elemento genético (mediada por el transposon) permite la fácil y rápida recopilación de miles de clones, que luego se pueden hacer para competir entre sí para seleccionar la posición óptima del elemento genético investigado (es decir, el clon más apto).
Aquí, D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores fueron financiados por subvenciones de la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación Lundbeck y la Fundación Nacional de investigación danés (DNRF120) a través del centro de respuesta bacteriana al estrés y persistencia (BASP).
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA Replication, Second Edition. , (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D’Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
