Очистка отсеке мембраны эндоплазматического ретикулума связаны деградации Экзогенные антигены в кросс презентация
Summary
Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки сотовой отсеков, где Экзогенные антигены обрабатываются эндоплазматического ретикулума связаны деградация в кросс презентации.
Abstract
Дендритные клетки (DCs) весьма способны обработки и представления интернализированных Экзогенные антигены класса гистосовместимости (MHC) я молекулы также известный как крест презентация (CP). CP играет важную роль не только в стимуляции наивно CD8+ T памяти CD8 клетки и+ T-клеток для инфекционных и опухоли иммунитета, но и в инактивации автоматической наивно T клетки Т-клеток анергия или удаления Т-клеток. Хотя критические молекулярный механизм CP предстоит быть выяснены, накапливая свидетельствуют, что Экзогенные антигены обрабатываются через эндоплазматического ретикулума связаны деградация (ERAD) после экспорта из Неклассические endocytic отсеков. До недавнего времени, характеристики этих endocytic отсеков были ограничены, потому что там было без конкретных молекулярных маркеров помимо Экзогенные антигены. Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки этих endocytic отсеков. Используя этот очищенный микросомы, мы восстановленный ERAD-как транспорт, ubiquitination и обработки экзогенных антигена в пробирке, предполагая, что убиквитин протеасом системы обработки экзогенных антигена после экспорта из этого Сотовый отсек. Этот протокол может применяться в других типах клеток для уточнения молекулярный механизм CP.
Introduction
MHC I молекулы выражаются на поверхности всех ядерных клеток, с короткие антигенные пептиды, производный от эндогенные антигены, которые обрабатываются системой убиквитин протеасом в цитозоль1. После обработки, антигенные пептиды переносятся в эндоплазматический ретикулум (ER) просвета пептида перевозчика крана. В просвете ER ряд конкретных сопровождающих помочь загрузки пептидной и правильный складывающиеся MHC I комплекс. Эта серия молекул называется загрузки пептидной комплекс (PLC), указав, что ER является центральный отсек для пептида, загрузки на MHC2. После загрузки, пептид MHC I молекулы переносятся на поверхности клеток и играть ключевую роль в адаптивной иммунной системы как самостоятельной маркеры и позволяет CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) для выявления раковых клеток или инфекционные агенты по антигенной пептиды от белков несамоуправляющихся3.
В антиген представляющих клеток (APC), антигенные пептиды из Экзогенные антигены, также представлены на MHC4,5,6,,78 через CP, который осуществляется главным образом по DCs9,10,11. CP имеет важное значение как для активации наивно CD8+ T памяти CD8 и клетки+ T клеток в борьбе с инфекционными и анти опухолевых ЦТЛ12,13и в поддержании иммунной толерантности путем инактивации из автоматическими наивные Т-клеток14,15. CP играет много важных ролей в адаптивной иммунной системы, однако молекулярных механизмов CP еще должны быть подробно описаны. Предыдущие исследования CP показали, что Экзогенные антигены были локализованы в ER и endosome и были обработаны ERAD, предполагая, что Экзогенные антигены транспортируются от endosome ER для обработки ERAD-как и пептида загрузки16 . Однако накапливая данные свидетельствуют, что загрузки пептидной CP осуществляется не в ER, но скорее в неклассической endocytic отсеках, которые также имеют отличительные черты ER (рис. 1)17,18 ,19,,2021. Чтобы избежать деградации антигенные пептиды прекурсоров, высокой активности aminopeptidase22 в цитозоле, обработки и пептида, погрузка в CP происходит в области проксимальных этих Неклассические endocytic отсеков (рис. 1). Хотя характеристики этих endocytic отсеками являются спорными, есть нет существующих конкретных молекул помимо Экзогенные антигены в этом отсеке.
ERAD является сотовой путь, который специально удаляет смятых протеинов от ER. В ERAD пути смятых протеинов retrogradely транспортируются через мембраны ER в цитоплазму и обработаны убиквитин протеасом системы23,24,25. Когда большие молекулы, такие как белки, транспортируются через липидный бислой, эти молекулы проходят через молекулярные аппарат, под названием translocon, как Sec61 комплекс и Дерлена комплекс в ER26и том комплекс и Тим комплекс в Митохондрии27. При экзогенно Добавлено антигены перевозятся через мембрану ER, они должны проникнуть липидного бислоя в комплексе с translocons, например Sec61 комплекс. Метод, описанный здесь очищенного целевых везикул, используя эти мембраны проникновение молекул как маркеры для endocytic отсеков.
Метод, описанный здесь-это новый протокол очистки пузырек с помощью DC-подобных клеток линии DC2.428 и биотинилированным овальбумина (Бова) как экзогенные антигена. Endocytic отсеках были очищены по стрептавидина (SA)-магнитные шарики с помощью мембраны проникая Бова как производитель. В этом очищенная микросомы, некоторые экзогенно добавлены Бова до сих пор сохранились в мембраны фракций, но были перевезены в наружной части микросомы, а затем убиквитинированных и обрабатываются в vitro29. Это очищенный микросомы содержатся не только endocytic отсек специфических белков, но и ER-резидентов белков для ERAD и пептида, Загрузка комплекса; предположить, что отсеке сотовой перспективных endocytic отсек для CP29. Этот протокол не зависит от вида Экзогенные антигены и применяется также для других подмножеств DC и другие типы клеток, макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток, уточнить точный молекулярный механизм DCs для опытным CP.
Protocol
Representative Results
Discussion
В предыдущих исследованиях CP включены Экзогенные антигены накопленных в запретной зоне конце endosome или ER immunofluorescent микроскопии16,30,,3132. Предполагается, что ERAD-как транспорта и обработки Экзогенные антигены осуществля?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Такасаки университет здравоохранения и социального обеспечения.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
