Endoplasmic जालिका के लिए झिल्ली के डिब्बे की शुद्धि-परस्पर प्रस्तुति में Exogenous एंटीजन के जुड़े क्षरण
Summary
यहां वर्णित विधि एक नया पुटिका आइसोलेशन प्रोटोकॉल है, जो सेलुलर डिब्बों के शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है जहां exogenous एंटीजन पार-प्रस्तुति में endoplasmic जालिका से जुड़े क्षरण की कार्रवाई की जाती है ।
Abstract
वृक्ष कोशिकाओं (dc) प्रसंस्करण और प्रमुख histocompatibility वर्ग (MHC) मैं भी पार-प्रस्तुति (सीपी) के रूप में जाना जाता अणुओं पर आंतरिक exogenous एंटीजन पेश करने में सक्षम हैं । सीपी न केवल की उत्तेजना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है भोली सीडी+ टी कोशिकाओं और स्मृति सीडी+ टी कोशिकाओं संक्रामक और ट्यूमर उन्मुक्ति के लिए लेकिन यह भी टी सेल anergy द्वारा आत्म अभिनय भोली टी कोशिकाओं की निष्क्रियता में या टी सेल विलोपन. यद्यपि सीपी के महत्वपूर्ण आणविक तंत्र का आविर्भाव होना शेष रहता है, ऐसे साक्ष्यों को संचित करने से संकेत मिलता है कि exogenous एंटीजन गैर-शास्त्रीय endocytic से निर्यात के बाद endoplasmic जालिका-संबद्ध क्षरण (ERAD) के माध्यम से संसाधित किए जाते हैं डिब्बों. अभी हाल तक इन endocytic डिब्बों की characterizations सीमित थीं क्योंकि exogenous एंटीजन के अलावा कोई विशिष्ट आणविक मार्कर नहीं थे. यहां वर्णित विधि एक नया पुटिका आइसोलेशन प्रोटोकॉल है, जो इन endocytic डिब्बों की शुद्धि के लिए अनुमति देता है । इस शुद्ध microsome का उपयोग कर, हम ERAD की तरह परिवहन, ubiquitination, और प्रसंस्करण मेंexogenous प्रतिजन की प्रक्रिया का पुनर्गठन, सुझाव है कि ubiquitin-proteasome प्रणाली इस से निर्यात के बाद exogenous प्रतिजन संसाधित सेलुलर कम्पार्टमेंट । इस प्रोटोकॉल को आगे अंय प्रकार के सेल के लिए लागू किया जा सकता है वाणिज्यिक पत्र के आणविक तंत्र स्पष्ट है ।
Introduction
MHC I अणुओं सभी nucleated कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं, अंतर्जात एंटीजन से व्युत्पंन लघु प्रतिजनी पेप्टाइड्स के साथ, जो proteasome में ubiquitin-cytosol प्रणाली द्वारा संसाधित कर रहे हैं1. प्रसंस्करण के बाद, प्रतिजनी पेप्टाइड्स पेप्टाइड ट्रांसपोर्टर नल द्वारा endoplasmic जालिका (एर) लुमेन में ले जाया जाता है । एर लुमेन में, विशिष्ट chaperones की एक श्रृंखला पेप्टाइड लोडिंग और MHC मैं परिसर की सही तह सहायता करते हैं । अणुओं की यह श्रृंखला पेप्टाइड-लोडिंग परिसर (पीएलसी) कहा जाता है, यह दर्शाता है कि एर MHC मैं2पर पेप्टाइड लदान के लिए एक केंद्रीय डिब्बा है । पेप्टाइड लदान के बाद, MHC मैं अणु सेल सतह तक ले जाया जाता है और आत्म मार्करों के रूप में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और सीडी+ साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs) को सक्षम बनाता है प्रतिजनी द्वारा कैंसर कोशिकाओं या संक्रामक एजेंटों का पता लगाने के लिए गैर से पेप्टाइड्स-स्व प्रोटीन3।
में antigen प्रस्तुत कक्ष (APC), exogenous एंटीजन से प्रतिजनी पेप्टाइड भी MHC मैं4,5,6,7,8 के माध्यम से सीपी, जो मुख्य रूप से किया जाता है पर प्रस्तुत कर रहे हैं आउट ऑफ dc9,10,11। वाणिज्यिक पत्र दोनों भोली सीडी+ टी कोशिकाओं और स्मृति सीडी+ टी कोशिकाओं विरोधी संक्रामक और विरोधी ट्यूमर CTLs12,13में सक्रियण के लिए आवश्यक है, और के निष्क्रिय द्वारा प्रतिरक्षा सहिष्णुता के रखरखाव में आत्म अभिनय भोली टी कोशिकाओं14,15। सीपी अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन वाणिज्यिक पत्र के आणविक तंत्र अभी तक विस्तार से वर्णित किया है । सीपी के पिछले अध्ययनों से पता चला कि exogenous एंटीजन ईआर और endosome दोनों में स्थानीयकृत थे और ERAD द्वारा संसाधित किए गए थे, सुझाव दे रहे हैं कि exogenous एंटीजन endosome से ईआर तक ERAD के लिए ले जाया जाता है-जैसे प्रोसेसिंग और पेप्टाइड लोडिंग16 . हालांकि, सबूत जमा इंगित करता है कि सीपी के पेप्टाइड लदान नहीं एर में किया जाता है बल्कि गैर शास्त्रीय endocytic डिब्बों में, जो भी एर की विशिष्ट सुविधाओं है (चित्रा 1)17,18 ,19,20,21. cytosol में aminopeptidase22 के उच्च गतिविधि द्वारा प्रतिजनी पेप्टाइड पुरोगामी की गिरावट से बचने के लिए, प्रसंस्करण और सीपीई में पेप्टाइड लोडिंग इन गैर-शास्त्रीय endocytic डिब्बों (चित्रा 1) के समीपस्थ क्षेत्र में होता है. हालांकि इन endocytic डिब्बों की characterizations विवादास्पद हैं, लेकिन इस डिब्बे में exogenous एंटीजन के अलावा कोई मौजूदा विशिष्ट अणु नहीं हैं.
ERAD एक सेलुलर मार्ग है, जो विशेष रूप से एर से निकला हुआ प्रोटीन निकालता है । ERAD मार्ग में, प्रगट प्रोटीन प्रतिगामी कोशिका को एर झिल्ली के माध्यम से ले जाया जाता है और ubiquitin-proteasome प्रणाली23,24,25द्वारा संसाधित । जब बड़े अणुओं, जैसे प्रोटीन, लिपिड bilayer के माध्यम से ले जाया जाता है, इन अणुओं एक आणविक उपकरण के माध्यम से पारित एक translocon, जैसे Sec61 परिसर और Derlin परिसर में एर26, और में टॉम कॉम्प्लेक्स और टिम परिसर mitochondria27. जब exogenously-जोड़ा एंटीजन एर झिल्ली के माध्यम से ले जाया जाता है, वे Sec61 परिसर जैसे translocons के साथ जटिल में लिपिड bilayer घुसना चाहिए । विधि यहां वर्णित इन झिल्ली का उपयोग करके लक्षित पुटिका शुद्ध-endocytic डिब्बों के लिए मार्कर के रूप में अणुओं मर्मज्ञ ।
विधि यहां वर्णित एक नई पुटिका शुद्धि प्रोटोकॉल का उपयोग कर डीसी की तरह सेल लाइन डीसी 2.428 और biotinylated ovalbumin (bOVA) एक exogenous प्रतिजन के रूप में । endocytic डिब्बों streptavidin (एसए) द्वारा शुद्ध थे-एक निर्माता के रूप में झिल्ली मर्मज्ञ bOVA का उपयोग चुंबकीय मोती । इस शुद्ध microsome में, कुछ exogenously जोड़ा bOVA अभी भी झिल्ली भागों में संरक्षित किया गया था, लेकिन microsome के बाहर तक ले जाया गया, और फिर ubiquitinated और इन विट्रो में29संसाधित । यह शुद्ध microsome न केवल endocytic डिब्बे-विशिष्ट प्रोटीन, लेकिन यह भी एर ERAD के लिए निवासी प्रोटीन और पेप्टाइड लोडिंग परिसर निहित; सुझाव है कि सेलुलर डिब्बा29सीपी के लिए भावी endocytic डिब्बे है । इस प्रोटोकॉल exogenous प्रतिजनों की तरह पर निर्भर नहीं है, और अन्य डीसी सबसेट और अन्य सेल प्रकार, जैसे मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, और endothelial कोशिकाओं के लिए भी लागू है, कुशल वाणिज्यिक पत्र के लिए dc की सटीक आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए.
Protocol
1. बढ़ती कोशिकाओं और Exogenous एंटीजन के अलावा एक बायोटिन-प्रोटीन लेबलिंग किट का प्रयोग कर bOVA तैयार करें निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल का पालन कर रहा है. नोट: साधारणतः, bOVA में 2 m बायोटिन प्रति 1 m ओवा औसतन होता है….
Representative Results
Discussion
सीपी के पिछले अध्ययनों में शामिल exogenous एंटीजन देर से endosome या ईआर के प्रतिबंधित क्षेत्र में संचित immunofluorescent माइक्रोस्कोपी16,30,31,३२. यह अनुमान है कि ERAD परिवहन और exogeno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को Takasaki यूनिवर्सिटी ऑफ हेल्थ एंड वेलफेयर ने सपोर्ट किया है ।
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
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