Rensing av membran kupé for endoplasmatiske retikulum-assosiert nedbrytning av eksogene antigener i Cross-presentasjon
Summary
Metoden beskrevet her er en ny vesicle isolasjon protokoll, som gjør det mulig for rensing av mobilnettet seksjonene der eksogene antigener behandles av endoplasmatiske retikulum-assosiert degradering av kryss-presentasjon.
Abstract
Dendrittiske celler (DCs) er svært kan presentere internalisert eksogene antigener ved store histocompatibility klasse (MHC) jeg molekyler også kjent som cross-presentasjon (CP). CP spiller en viktig rolle ikke bare i stimulering av naiv CD8+ T celler og minne CD8+ T celler smittsomme og svulst immunitet men også i inaktivering av selvstendig fungerende naiv T celler av T celle anergy eller T celle sletting. Selv om kritiske molekylær mekanisme CP gjenstår å bli belyst, indikerer samler bevis at eksogene antigener behandles gjennom endoplasmatiske retikulum-assosiert degradering (ERAD) etter eksport fra ikke-klassiske endocytic rom. Inntil nylig var characterizations av endocytic seksjonene begrenset fordi det var ingen spesifikke molekylære markører enn eksogene antigener. Metoden beskrevet her er en ny vesicle isolasjon protokoll, som gjør det mulig for rensing av endocytic seksjonene. Bruker denne renset microsome, rekonstituert vi ERAD som transport, ubiquitination, og behandlingen av ytre antigen i vitro, antyder at ubiquitin-proteasome systemet behandlet eksogene antigen etter eksport fra dette mobilnettet rommet. Denne protokollen kan brukes videre til andre celletyper å avklare molekylær mekanisme CP.
Introduction
MHC jeg molekyler er uttrykt på overflaten av alle kjerne celler, med kort antigen peptider fra endogene antigener, som behandles av ubiquitin-proteasome systemet i stoffer1. Etter prosessering transporteres antigen peptider i det endoplasmatiske retikulum (ER)-lumen med den peptid transporter trykk. I ER lumen, en rekke spesifikke chaperones hjelper peptid lasting og riktig folding av MHC jeg komplekse. Denne serien av molekyler kalles peptid-lasting komplekset (PLC), indikerer at ER en sentral avlukke for peptid lasting på MHC jeg2. Etter peptid lasting, MHC jeg molekyler transporteres til celleoverflaten og spiller en viktig rolle i det adaptive immunsystemet som selv markører og aktiverer CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) å oppdage kreftceller eller smittsomme stoffer av antigen peptider fra ikke-selv proteiner3.
I antigen presentere celler (APC), antigen peptider fra eksogene antigener er også presentert på MHC jeg4,5,6,7,8 via CP, som gjennomføres hovedsakelig ut av DCs9,10,11. CP er viktig både for aktivering av naiv CD8+ T celler og minne CD8+ T celler til anti-smittsomme og anti-tumoral CTLer12,13, og i vedlikehold av immun toleranse av inaktivere av selv fungerende naiv T celler14,15. CP spiller mange viktige roller i det adaptive immunsystemet, men de molekylære mekanismene av CP har ennå å bli beskrevet i detalj. Tidligere studier av CP avslørte at eksogene antigener ble lokalisert både ER og endosome og ble behandlet av ERAD, antyder at eksogene antigener transporteres fra endosome til ER for ERAD-lignende behandling og peptid lasting16 . Imidlertid indikerer samler bevis at peptid lasting av CP utføres ikke i ER men i ikke-klassiske endocytic avdelinger, som også har karakteristiske trekk ved de ER (figur 1)17,18 ,19,20,21. For å unngå nedbrytning av antigen peptid forløpere av den høye aktiviteten til aminopeptidase oppstår22 i stoffer, behandling og peptid lasting i CP i det proksimale området av ikke-klassiske endocytic seksjonene (figur 1). Karakteristikkene av endocytic seksjonene er kontroversielle, finnes det ingen eksisterende bestemt molekyler enn eksogene antigener i dette rommet.
ERAD er en mobilnettet sti, som spesielt fjerner misfolded proteiner fra ER. I ERAD veien, misfolded proteiner retrogradely transportert gjennom ER membran til cytoplasma og behandles av ubiquitin-proteasome systemet23,24,25. Når store molekyler, som proteiner, transporteres gjennom lipid bilayer, disse molekylene passere en molekylær apparater kalt en translocon, som Sec61 kompleks og Derlin i ER26, og Tom komplekse og Tim kompleks i den mitokondrier27. Når exogenously-lagt antigener transporteres gjennom ER membran, må de trenge lipid bilayer i kompleks med translocons, som Sec61 komplekset. Metoden beskrevet her renset målrettet vesicle ved å benytte disse membran-gjennomtrengende molekyler som markører for endocytic seksjonene.
Metoden beskrevet her er en ny vesicle rensing protokollen bruker i DC-like cellen linje DC2.428 og biotinylated ovalbumin (bOVA) som et eksogene antigen. Endocytic seksjonene ble renset ved streptavidin (SA)-magnetiske perler med membran-gjennomtrengende bOVA som en maker. I denne renset microsome, noen exogenously lagt bOVA ble bevart i membranen fraksjoner, men ble transportert til utsiden av microsome, og deretter ubiquitinated og behandlet i vitro29. Denne renset microsome inneholdt ikke bare endocytic rom-spesifikke proteiner, men også ER-resident proteiner ERAD og peptid lasting sammensatt; antyder at mobilnettet rommet er potensielle endocytic batterirommet CP29. Denne protokollen er ikke avhengig av hva slags eksogene antigener, og gjelder også for andre DC delsett og andre celletyper, som makrofager, B-celler og endotelceller, å avklare presise molekylære mekanismen av DCs for dyktige CP.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tidligere studier av CP akkumulert innarbeidet eksogene antigener i begrensede området av sen endosome eller ER ved immunofluorescent mikroskopi16,30,31,32. Det er anslått at ERAD-lignende transport og behandling av eksogene antigener er gjennomført i disse spesialiserte områder ER eller sene endosome, som cellular rommet ble identifisert av sukrose eller iodixanol tetthet gradert sentrif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av Takasaki universitetet av helse og velferd.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
