Rening av membran facket för endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytningen av exogena antigen i Cross-presentation
Summary
Den metod som beskrivs här är en ny vesikler isolering protokoll, vilket tillåter för rening av de cellulära fack där exogena antigen bearbetas av endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytning i cross-presentation.
Abstract
Dendritiska celler (DCs) är mycket kapabel för bearbetning och presentation av internaliserade exogena antigen vid större histocompatibility klass (MHC) jag molekyler kallas även cross-presentation (CP). CP spelar en viktig roll inte bara i stimulering av naiva CD8+ T celler och minne CD8+ T-celler för smittsamma och tumör immunitet men också i inaktivering av självverkande naiva T-celler T cell anergi eller T cell radering. Även om den kritiska molekylära mekanismen av CP återstår belysas, indikerar ackumulerande bevis att exogena antigen bearbetas via endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytning (ERAD) efter export från icke-klassisk endocytic fack. Tills nyligen, var karakteriseringar av dessa endocytic avdelningar begränsade eftersom det fanns inga specifika molekylära markörer än exogena antigen. Den metod som beskrivs här är en ny vesikler isolering protokoll, vilket tillåter för rening av dessa endocytic fack. Använder denna renat levermikrosom, beredas vi den ERAD-liknande transporter, ubikvitinering och bearbetning av exogena antigen i vitrotyder på att den ubiquitin-proteasomsystemet bearbetas den exogena antigenen efter export från denna mobilfack. Detta protokoll kan tillämpas vidare till andra celltyper att klargöra den molekylära mekanismen av CP.
Introduction
MHC jag molekyler som uttrycks på ytan av alla kärnförsedda celler, med korta antigena peptider som härrör från endogena antigener, som behandlas av den ubiquitin-proteasomsystemet i cytosolen1. Efter bearbetning transporteras antigena peptider i endoplasmatiska nätverket (ER) lumen av peptid transportören TAP. En rad specifika chaperones bistå ER lumen, peptid lastning och den rätta vikningen av MHC I komplexa. Denna serie av molekyler kallas peptid-lastning komplexet (PLC), vilket indikerar att akuten är ett centralt kompartment för peptid lastning på MHC jag2. Efter lastning, peptiden till MHC jag molekyler transporteras till cellytan och spela en nyckelroll i det adaptiva immunsystemet som själv markörer och möjliggör CD8+ cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) att upptäcka cancerceller eller infektiösa agens av antigen peptider från icke-själv proteiner3.
I antigenpresenterande celler (APC), antigen peptider från exogena antigen är också presenteras på MHC jag4,5,6,7,8 via CP, som bärs främst ut av DCs9,10,11. CP är viktigt både för aktivering av naiva CD8+ T celler och minne CD8+ T celler in i anti-infektiösa och anti-tumoral CTL12,13, och i underhållet av immuntolerans av det inactivating av själv tillförordnade naiva T-celler14,15. CP spelar många viktiga roller i det adaptiva immunsystemet, men molekylära mekanismer för CP har ännu inte beskrivas i detalj. Tidigare studier av CP avslöjade att exogena antigen var lokaliserade både ER och endosome och bearbetades av ERAD, vilket tyder på att exogena antigen transporteras från endosome till ER för ERAD-liknande bearbetning och peptid som laddar16 . Ackumulerande bevis tyder dock på att peptid lastning av CP utförs inte i ER utan snarare i icke-klassisk endocytic fack, som också har särdrag av ER (figur 1)17,18 ,19,20,21. För att undvika nedbrytning av antigena peptid prekursorer av hög aktivitet av aminopeptidase uppstår22 i cytosolen, bearbetning och peptid lastning i CP i området proximalt i dessa icke-klassisk endocytic fack (figur 1). Även karakteriseringar av dessa endocytic fack är kontroversiell, finns det inga befintliga specifika molekyler än exogena antigen i detta fack.
ERAD är en cellulär väg, som specifikt tar bort felveckning proteiner från ER. I ERAD väg, felveckning proteiner retrogradely transporteras genom ER membranet till cytoplasman och bearbetas av ubiquitin-proteasom systemet23,24,25. När stora molekyler, såsom proteiner, transporteras genom den lipid lipidens, dessa molekyler passera en molekylär apparat som kallas en translocon, såsom Sec61 komplex och Derlin komplex i den ER26, och Tom komplexa och Tim komplex i den mitokondrier27. När exogent-lade antigener transporteras genom ER membranet, måste de tränger den lipid lipidens i komplex med translocons, såsom Sec61 komplexet. Den metod som beskrivs här renas det riktade vesikler genom att utnyttja dessa membran-penetrerande molekyler som markörer för endocytic facken.
Den metod som beskrivs här är ett nytt vesikler rening protokoll med hjälp av DC-liknande cell linje DC2.428 och biotinylerade äggalbumin (bOVA) som exogena antigen. Endocytic facken var renas genom streptividin (SA)-magnetiska pärlor med den membran-penetrerande bOVA som en maker. I denna renat levermikrosom, lite extra exogent bOVA var fortfarande finns bevarade i membran fraktioner men var transporteras till utsidan av levermikrosom, och sedan ubiquitineras och bearbetas i vitro29. Denna renade levermikrosom innehöll inte bara endocytic fack-specifika proteiner, utan också ER boförälder proteiner för ERAD och peptiden lastning komplex; tyder på att mobilfack är det blivande endocytic facket för CP29. Detta protokoll är inte beroende av vilken typ av exogena antigen, och är även tillämplig för andra DC underdelar och andra celltyper, såsom makrofager, B-celler och endotelceller, att klarlägga den exakta molekylära mekanismen av DCs för skickliga CP.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tidigare studier av CP ackumulerade de bolagiserade exogena antigenerna i det begränsade området av sena endosome eller ER av Immunofluorescerande mikroskopi16,30,31,32. Det uppskattas att ERAD-liknande transporter och bearbetning av exogena antigen genomförs i dessa specialiserade områden av ER eller sent endosome, som mobilfack identifierades av sackaros eller iodixanol täthet lutning …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Takasaki universitet av hälsa och välbefinnande.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
