Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker
Summary
Een protocol voor de oprichting van een genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker door middel van segmentale adeno-cre infectie en zijn bewaking via hoge resolutie colonoscopie wordt gepresenteerd.
Abstract
Ondanks de voordelen van makkelijke toepasselijkheid en kosteneffectiviteit, hebben muskelkankermuizenmodellen op basis van tumorcelinjectie ernstige beperkingen en worden de tumorbiologie en tumorcel-verspreiding niet nauwkeurig gesimuleerd. Genetisch gemanipuleerde muismodellen zijn geïntroduceerd om deze beperkingen te overwinnen; Dergelijke modellen zijn echter technisch veeleisend, met name in grote organen zoals de dikke darm waarin slechts een enkele tumor gewenst is.
Als gevolg daarvan werd een immunocompetent, genetisch gemanipuleerd muismodel van colorectale kanker ontwikkeld die zeer uniforme tumoren ontwikkelt en kan gebruikt worden voor tumorbiologie studies en therapeutische proeven. Tumorontwikkeling wordt geïnitieerd door chirurgische, segmentale infectie van de distale dikke darm met adeno-cre-virus in samengestelde voorwaardelijke mutante muizen. De tumoren kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd en gecontroleerd via colonoscopie. Hier beschrijven we de chirurgische techniek van segmentale adeno-cre infectie vanDe dikke darm, het bewaken van de tumor via hoge resolutie colonoscopie en presenteren de resulterende colorectale tumoren.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) blijft een van de belangrijkste oorzaken van kankerverwante dood in westerse landen. 1 Terwijl de prognose van patiënten met vroegtijdige ziekte goed is, worden veel tumoren gediagnosticeerd in latere fasen, waarbij de prognose ondanks talrijke behandelingsopties beperkt is. 2 , 3 , 4 , 5
De meerderheid van de huidige muismodellen van CRC zijn gebaseerd op de implantatie van tumorcellen afgeleid van cellijnen of patiënttumoren in immunodeficiënte muizen. 6 , 7 , 8 Dit leidt tot lokale en, afhankelijk van de injectieplaats en de tumorcellen die worden gebruikt voor injectie, soms metastatische tumoren. 9 , 10 Maar de resulterende xenograftmodellen hebben majoBeperkingen. Ze moeten worden vastgesteld in immunodeficiënte muizen, waardoor de complexe interactie tussen de tumor en het immuunsysteem van de gastheer wordt opgeheven. Bovendien, aangezien het tumorstroma afgeleid is van gastheercellen, is de interactie tussen humane tumorparenchyma en muizenstroma defect en derhalve niet representatief voor de ziekte. Deze tekortkomingen kunnen vermeden worden door het gebruik van muizencellijnen voor injectie. Echter, er zijn maar weinig muizen CRC-cellijnen beschikbaar en, vergelijkbaar met de meeste beschikbare humane CRC-cellijnen, zijn monoklonale en zeer anaplastische. 11 Kortom, de meeste beschikbare CRC-muismodellen zijn zeer kunstmatig en niet volledig representatief voor de menselijke ziekte.
Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) van CRC kunnen deze nadelen vermijden aangezien zij echte muistumoren bevatten die worden gecreëerd via inductie van belangrijke mutaties van CRC in de dikke darm. 12 , 13 ,14 Dit kan worden bereikt door de activatie van conditional (floxed) germline mutaties door cre recombinase binnen de colorectale mucosa. Terwijl in GEMM's van veel andere tumorentiteiten kiemlijn (induceerbare) cre-expressie wordt aangedreven door weefselspecifieke promotors, kan germline cre niet in de dikke darm worden gebruikt, aangezien dit leidt tot een groot aantal adenomen in de dikke darm waardoor de dood door goedaardige tumorbelasting bij Een zeer jonge leeftijd. Daarom wordt in het hier beschreven model een adenovirale vectoruitdrukkende cre gebruikt om een kort darmsegment te infecteren. Dit leidt tot de inductie van tumorigenese binnen dit segment van de slijmvliezen op een tijdstip bepaald door de onderzoeker, waardoor adenomen uiteindelijk naar invasieve en metastatische carcinoom gaan. De tumoren zijn echte muistumoren, groeien in een intacte microomgeving en kunnen daarom het geheel van colorectale oncogenese simuleren, waaronder tumor-gastheerinteractie en de metastatische cascade. Dit model isDaarom een aantrekkelijk platform voor studies van kankerbiologie en preklinische therapeutische proeven.
Een belangrijk nadeel van genetisch gemanipuleerde muismodellen van CRC is hun technische complexiteit. Lokale bezorging met behulp van rectale adeno-cre enemas in muizen die gevlochten Apc allelen heeft, is eerder beschreven; Echter, de incidentie, multipliciteit en plaats van de darm tumoren kunnen zeer variabel zijn met deze techniek. 15 Daarom is de techniek om de adeno-cre infectie te beperken door chirurgische klemmen van het te induceren segment te ontwikkelen. 13 Wij hebben deze procedure aangepast om het dierenwelzijn te verbeteren, evenals de sterfte en het aantal resulterende tumoren te verminderen. Met dit protocol moeten alle laboratoria met ervaring in kleine knaagdierchirurgie het model kunnen reproduceren en tumoren produceren die zeer reproduceerbaar en gemakkelijk toegankelijk zijn voor colonoscopie. Afhankelijk van de voorwaardelijke mUitingen die worden gebruikt voor tumorigenese, kan het volledige spectrum van adenoom, invasieve carcinoom en metastasen waargenomen worden. Aangezien de tumoren zich in de distale dikke darm bevinden, is seriële endoscopische beoordeling eenvoudig in dit model mogelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel ze over het algemeen makkelijk te genereren en te onderhouden zijn, zijn klassieke CRC-muismodellen op basis van cellijninjectie kunstmatig en kunnen ze de menselijke ziekte niet volledig herhalen. Als gevolg hiervan zijn GEMM's ontwikkeld. De eerste CRC GEMM was de Apc Min muis, die een heterozygotische null mutatie in het Apc gen heeft, waardoor de menselijke erfelijke ziekte familiale adenomatische polyposis (FAP) nabootst. 21 Apc Min muizen ontwikkelen echter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is gewijd aan de herinnering van professor Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. Fasting of mice: a review. Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).
