Summary
Ett protokoll för upprättandet av en genmodifierad musmodell av kolorektal cancer genom segmentad adeno-cre-infektion och dess övervakning via kolonoskopi med hög upplösning presenteras.
Abstract
Trots fördelarna med enkel användbarhet och kostnadseffektivitet har muskelmodeller med kolorektal cancer baserat på tumörcellinsprutning svåra begränsningar och simulerar inte noggrant tumörbiologi och tumörcellspridning. Genetiskt konstruerade musmodeller har införts för att övervinna dessa begränsningar; Emellertid är sådana modeller tekniskt krävande, speciellt i stora organ, såsom kolon, i vilket endast en enda tumör önskas.
Som ett resultat av detta utvecklades en immunokompetent, genetiskt konstruerad musmodell av kolorektal cancer som utvecklar starkt likformiga tumörer och kan användas för tumörbiologiska studier såväl som terapeutiska försök. Tumörutveckling initieras genom kirurgisk, segmentinfektion i distal kolon med adeno-cre-virus i kompositionen villkorligt mutanta möss. Tumörerna kan lätt detekteras och övervakas via koloskopi. Här beskrivs kirurgisk teknik för segmentad adeno-cre-infektion avKolon, övervakning av tumören via kolonoskopi med hög upplösning och uppvisande de resulterande kolorektala tumörerna.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) fortsätter att vara en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad död i västra länder. 1 Även om prognosen hos patienter med tidig sjukdom är bra, diagnostiseras många tumörer vid senare skeden, där prognosen är begränsad trots många behandlingsalternativ. 2 , 3 , 4 , 5
Majoriteten av nuvarande musmodeller av CRC är baserade på implantering av tumörceller härledda från cellinjer eller patienttumörer till immundeficenta möss. 6 , 7 , 8 Detta leder till lokala och, beroende på injektionsstället och de tumörceller som används för injektion, ibland metastatiska tumörer. 9 , 10 De resulterande xenograftmodellerna har emellertid majoR begränsningar. De måste etableras i immunbristande möss, vilket eliminerar den komplexa interaktionen mellan tumören och värdimmunsystemet. Eftersom tumörstromen härleds från värdceller är dessutom interaktionen mellan humant tumörparenkym och murin stroma defekt och därför inte representativ för sjukdomen. Dessa brister kan undvikas genom användning av murincellinjer för injektion. Emellertid är endast få murina CRC-cellinjer tillgängliga och, liknande de flesta tillgängliga humana CRC-cellinjer, är monoklonala och mycket anaplastiska. 11 Sammanfattningsvis är de flesta tillgängliga CRC-musmodellerna mycket artificiella och inte fullständigt representativa för den mänskliga sjukdomen.
Genetiskt manipulerade musmodeller (GEMM) hos CRC kan undvika dessa nackdelar, eftersom de uppvisar äkta mustumörer som skapas via induktion av nyckelmutationer av CRC i kolon. 12 , 13 ,14 Detta kan åstadkommas genom aktivering av betingade (floxed) kimlinjemutationer genom cre rekombinas inom kolorektal slemhinna. Medan i GEMM från många andra tumörenheter används germline (inducerbart) cre-uttryck som drivs av vävnadsspecifika promotorer, kan germline cre inte användas i tjocktarmen, eftersom detta leder till ett stort antal adenomer i hela tjocktarmen som orsakar död genom godartad tumörbelastning vid En mycket ung ålder. Därför används i den här beskrivna modellen en adenoviral vektoruttryckande cre för att infektera ett kort tjocktarmsegment. Detta leder till induktion av tumörgenesen inom detta segment av slemhinnan vid en tidpunkt som definierats av undersökaren, vilket resulterar i adenomer som i slutändan utvecklas till invasivt och metastatiskt karcinom. Tumörerna är äkta mustumörer, växer i en intakt mikromiljö och kan därför simulera helheten av kolorektal onkogenes inklusive tumör-värd-interaktion och metastatisk kaskad. Denna modell ärDärför en attraktiv plattform för studier av cancerbiologi och prekliniska terapeutiska studier.
En stor nackdel med genetiskt modifierade musmodeller av CRC är deras tekniska komplexitet. Lokal cre-leverans med användning av rektala adeno-cre-enemas i möss som bär floxade Apc-alleler har beskrivits tidigare; Emellertid kan incidensen, multipliciteten och placeringen av tarmtumörerna vara mycket variabel med denna teknik. 15 Därför har tekniken att begränsa adeno-cre-infektionen genom kirurgisk klämning av segmentet som skall induceras utvecklats. 13 Vi har ändrat denna procedur för att förbättra djurs välbefinnande, samt minska dödligheten och antalet resulterande tumörer. Med detta protokoll bör alla laboratorier med erfarenhet av liten gnagareoperation kunna reproducera modellen och producera tumörer som är mycket reproducerbara och lättillgängliga för koloskopi. Beroende på den villkorliga mUtationer som används för tumörigenes, hela spektret av adenom, invasivt karcinom och metastaser kan observeras. Eftersom tumörerna ligger i distal kolon, är seriell endoskopisk bedömning lätt möjlig i denna modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De djurförsök som presenteras här utvärderades oberoende av och godkändes av en institutionell och en statlig djurvårds- och användningskommitté och genomfördes enligt riktlinjerna för FELASA (Federation of Laboratory Animal Science Associations). Alla möjliga åtgärder vidtogs för att minimera lidande inklusive anestesi och analgesi eller vid behov prematur eutanasi.
1. Lokal tumörinduktion via kirurgisk adeno-cre-infektion
- Framställning av djur för operation
OBS! Praktiskt taget alla villkorliga ("floxed") mutationer kan induceras via den här beskrivna metoden. Användningen av mutationer i gener som är relevanta för kolorektal cancer, såsom Apc, Kras eller Tp53 rekommenderas. Effektiviteten av cre-rekombination beror på storleken på konstruktionen som ska exciseras. Stora floxade sekvenser skärs mindre effektivt. Rekombinationen av alla alleler bör bekräftas i tumörerna genom PCR.- För utveckling av kolorektala tumörer, använd ett kors av följande villkorliga alleler för en grundläggande modell av CRC (MGI-databasnummer inom parentes):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Om en fluorescensreporter allel krävs ( t.ex. för att detektera mikrometastaser), använd följande allel:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
OBS! Alla ovanstående stammar är tillgängliga via NCI Mouse Repository eller Jackson Laboratory. Ingen fasta är nödvändig eftersom all återstående fekalämne kan spolas ut före adenoviralinfektion. Preoperativ fastning leder till högre perioperativ dödlighet och utgör en enorm stress för små gnagare. - Använd sevofluran vid 3 - 3,5 volymprocent för allmän anestesi. En förlust av tHan tippa reflex indikerar tillräcklig anestesi.
- Före första snittet injicera 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant.
- Täck ögonen på den bedövade musen med oftalmisk salva för att undvika uttorkning av hornhinnan.
- Placera musen i en bakre position på ett litet bord. Använd icke-traumatiska limband för att hålla musen kvar.
- Raka buken med en elektrisk rakapparat (depilatory cream kan användas alternativt) och desinficera med alkoholpinnen eller jod. Använd den kontakttid som rekommenderas av tillverkaren.
- Täck det kirurgiska fältet med sterila draperier.
OBS! Användningen av perioperativa antibiotika är frivillig och underställd institutionella riktlinjer. - Använd steril engångsbruk eller steriliserade instrument för alla kirurgiska ingrepp.
- För utveckling av kolorektala tumörer, använd ett kors av följande villkorliga alleler för en grundläggande modell av CRC (MGI-databasnummer inom parentes):
- Midline laparotomi och exponering av tjocktarmen
- Använd sax (skalpeller kan användas alternativt) för att göra en mittlinje snitt(~ 15 mm) av huden på underlivet.
- Plocka upp bukväggen muskulaturen med pincett och försiktigt incise det med sax, så att bukhålan öppnas.
- Identifiera den distala kolon, bara rör den med atraumatiska tångar. Kläm kolon med en känslig klämma ( t.ex. en Micro Serrefine vaskulär klämma) ca 15 mm proximalt av anus.
OBS! Var särskilt uppmärksam på kolonens sårbarhet hela tiden. Perforering leder oundvikligen till peritonit och sepsis och kräver eutanasi hos djuret.
- Segment-koloninfektion med Adeno-cre-virus
- Sätt in ett flexibelt Teflon-rör transanalt och försiktigt förflytta det tills det når lumen ocklusion uppnådd av klämman som tidigare placerats vid 15 mm från anal-gränsen. Använd inte överdriven kraft eftersom detta kan leda till perforering.
- Cannulera röret med en 30G kanyl, anslut en standard 1 ml spruta och spola coloN med normal saltlösning för att evakuera återstående fekalämne. Detta kan kräva flera ml saltlösning.
- När den distala kolon är tomt, ta av röret och byt ut det med ett nytt Teflon-rör och sätt det igen distalt till klämman enligt ovan.
- Avlägsna kolon med en andra klämma ~ 3 mm distal mot proximalklämman ( dvs. över det infogade röret, ~ 12 mm från den anala gränsen), vilket resulterar i ett 3 mm isolerat segment som ska infekteras.
ANMÄRKNING: För distal ocklusion av segmentet har Fogarty kransartärklemmen visat sig lämpligast när de gummeras, vilket leder till tät ocklusion av tjocktarmen trots det intraluminala röret mellan klämans grenar. - Använd en andra spruta (standard 1 ml med en 30 g kanyl) för noggrant injicera 50 - 80 μl 0,25% trypsin-EDTA i det klämda kolonsegmentet och inkubera i 10 minuter. Låt kanylen och sprutan fästa på Teflon-röret för att förhindra att vätskan läcker tillbaka.
- Ta först bort den distala klämman och sedan trypsinröret.
- Spola den distala kolon med ~ 500 μL normal saltlösning för att avlägsna resterande trypsin.
- Sätt in ett nytt Teflon-rör, sätt tillbaka den distala klämman och sätt upp kolonsegmentet med 50- 80 μl adenoviral lösning (10 11 plackbildande enheter (PFU) / ml i fosfatbuffrad saltlösning) och inkubera i 30 minuter ( Figur 2A ).
OBS! Spruta inte viral lösning eftersom kontakt med adeno-cre kan leda till tumörutveckling i någon vävnad av villkorligt mutanta möss. - Ta bort klämmorna och röret.
- Stängning av buken och postoperativ återhämtning
- Stäng bukväggen med 6-0 snabbt absorberbar körningTures ( t.ex. polydioxanon (PDS)).
- Stäng huden med kirurgiska sårklämmor.
- Placera musen på värmepuden ställd till 38 ° C tills den har helt återhämtat sig från anestesen.
- Administrera en annan bolus på 0,05 mg / kg buprenorfin ip 12 timmar efter operationen, följt av ytterligare buprenorfin-bolus varje 12 h om det behövs.
- Övervaka mössen minst en gång dagligen för tecken på nöd på grund av tumörtillväxt.
2. Koloskopi
OBS: Beroende på de använda villkorliga mutationerna leder adenovirusinfektion till endoskopiskt synliga tumörer inom 2-4 veckor. Utför därför den första postoperativa koloskopi 2 veckor efter adenoviral induktion och upprepa varannan vecka. Ett kommersiellt tillgängligt system rekommenderas för murin koloskopi. 20
- Framställning av djur för koloskopi
OBS! Ingen fasta är required. Återstående fekalämne är vanligtvis välformad i distal kolon och kan skjutas bortom tumören under koloskopi, vilket gör den stressiga processen med upprepad fastning onödig.- Använd sevofluran vid 3 - 3,5 volymprocent för allmän anestesi. En förlust av tånklämningsreflexen indikerar tillräcklig anestesi.
- Täck ögonen på de bedövade mössen med oftalmisk salva för att undvika uttorkning av hornhinnan.
- Håll musen bakåt i ett litet bord.
- koloskopi
- Sätt in räckvidden (diameter 1,9 mm, längd 10 cm) i tarmkanalen genom anusen och försiktigt insufflat luft under visuell kontroll för att distansera tjocktarmen. Insufflera inte mer luft än vad som krävs för undersökningen.
ANMÄRKNING: För luftinsufflation kan kolonoskopiets antidumpluftspump användas. Om ingen luftdämpare är tillgänglig, kan alla andra luftpumpar med mycket lågtrycksinställningar användas eller föreSsuriserad luft med en känslig tryckreducerande ventil. Koldioxid (CO 2 ) leder lätt till acidos hos små gnagare och måste därför undvikas. - Tryck försiktigt räckvidden framåt tills en slemhinneskada i distal kolon kan identifieras ( Figur 1A-1D ).
- Spara endoskopiska bilder för senare utvärdering. Ett endoskopiskt poängsystem för intraluminala tumörer har tidigare beskrivits. 20
- Ta försiktigt bort räckvidden och placera musen på värmepuden ställd till 38 ° C tills den har helt återhämtat sig från anestesen.
- Sätt in räckvidden (diameter 1,9 mm, längd 10 cm) i tarmkanalen genom anusen och försiktigt insufflat luft under visuell kontroll för att distansera tjocktarmen. Insufflera inte mer luft än vad som krävs för undersökningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om adekvat utförs, utvecklar> 85% av djuren tumörer. Dödligheten för det här presenterade kirurgiska förfarandet är <5%, dödligheten i koloskopi är praktiskt taget obefintlig. I de flesta möss detekteras en enda skada; I ca 30% kan 2-3 små adenom detekteras som normalt smälter till en enda tumör inom 2-3 veckor efter tumörinduktion.
Fenotypen och biologiskt beteende hos de resulterande tumörerna är starkt beroende av djurens villkorliga mutationer. Den lokala förmedlade knockouten av Apc är tillräcklig för att inducera tumörgenes och leder initialt till adenom, vilket kan detekteras 2-4 veckor efter adenovirusinfektion och som utvecklas till invasivt adenokarcinom inom 12-16 veckor. Denna process kan accelereras genom att lägga till en villkorlig onkogen Kras-mutation (Kras G12D), de resulterande tumörerna utvecklas snabbt till invasivaadenokarcinom. Vid tillsats av onkogen Tp53 R172H utvecklas tumörerna snabbt till invasivt och metastatiskt karcinom. Överlevnad beror starkt på tumörernas genotyp; Medianöverlevnad är vanligen cirka 80-200 dagar efter tumörinduktion. Dödsorsaken i de allra flesta fall är stor tarmobstruktion som är sekundär för tumörtillväxt.
Tumörerna kan enkelt och upprepade gånger övervakas via koloskopi ( Figur 1 ) utan större stress för djuren.
Sjukdoms manifestationerna är mycket likna mänskliga CRC. Djuren utvecklar adenom och i slutändan adenokarcinom i distal kolon ( figurerna 2B, 2C, 2F ). Beroende på musens villkorliga genotyp metastaseras tumörerna också till bukhinnan ( Figur 2D ), leverna ( Figur 2E ) och sällsynta Lungorna (ej visade). Om en cre reporterareal ( t.ex. ZSGreen 19 ) används, kan alla tumör manifestationer enkelt identifieras. ZSGreen-reporterallelen har ett fluorescerande proteinuttryck som är tillräckligt ljust för att vara synligt vid dagsljus ( Figur 1B , Figur 2C ).
Histologiskt är 95% av de utvecklande tumörerna adenokarcinom. Cirka 5% av tumörerna har mesenkymalt ursprung, t ex fibrosarkom eller leiomyosarkom, som antagligen utvecklas från stromala celler som oavsiktligt smittats med adeno-cre. Histomorfologin hos adenokarcinom liknar i hög grad mänsklig CRC, som uppvisar hela spektrumet från icke-invasivt adenom till adenokarcinom invaderande omgivande strukturer ( Figur 3A-3C ).
Filer / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
Figur 1. Koloskopiska bilder av kolorektala tumörer (villkorliga alleler av det givna djuret i parenteser).
A. Normal distal kolon. B. Tidigt adenom 2 veckor efter adeno-cre infektion. Notera den gröna färgen på grund av en GFP-reporterallel i den här musen. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Sen adenom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. Colorektal adenokarcinom (som diagnostiserats av patologi efter det att kolonoskopibilderna erhölls; Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
2.jpg "/>
Figur 2. A. Intraoperativ Situs . Notera det stora, gummerade Fogarty-klippet längst ner och det transanalt inlagda röret för adeno-cre-injektion (röd pil). B. Colorectal tumör (vit pil) med konsekutiv stor tarmobstruktion 8 veckor efter adeno-cre-infektion (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Kolorektal tumör (vit pil) 10 veckor efter adeno-cre infektion (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Notera den gröna färgen på grund av en grön fluorescerande protein (GFP) reporterallel i denna mus. D. Peritoneal karcinos (svarta pilar) i GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Lever och tarmen har tagits bort för att exponera njurarna och membranet. E. Brutto levermetastaser i GEMM 12 veckor efter adeno-cre iFection (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colon med tumör efter avlägsnande från djuret avbildat i figur 2C . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Hematoxylin / Eosin (H / E) färgade sektioner av kolorektala tumörer från GEMM.
A. Övergångszon från normal slemhinna till adenokarcinom med infiltrering av slemhinnor, submukosa och muskulär slemhinna (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Övergångszon från normal kolonslimhinna till invasivt adenokarcinom (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Högkvalitativt adenokarcinom med infiltrering av omgivande vävnad (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan de generellt är lätta att generera och underhålla, är klassiska CRC-musmodeller baserade på cellinjektion artificiella och kan inte fullständigt rekapitulera den mänskliga sjukdomen. Som en konsekvens har GEMMs utvecklats. Den första CRC GEMM var Apc Min- musen, som har en heterozygot null-mutation i Apc-genen, och efterliknar därför den mänskliga ärftliga sjukdomen familial adenomatous polyposis (FAP). 21 Apc Min- möss utvecklar emellertid oundvikligen flera intestinala adenomer som inte är begränsade till kolon; Även tid och exakt placering av adenombildning är slumpmässigt och tumörerna utvecklas sällan till maligna lesioner, eftersom musen dör av godartad tumörbelastning innan adenomen kan utvecklas. Därför är Apc Min- musen en modell av FAP, inte sporadisk CRC. Andra modeller presenterar mutationer i DNA-mismatch reparationsgener. 22 , 23 Även om några av dessaMöss är utmärkta modeller för ärftlig gastrointestinal cancer, de representerar inte sporadisk kolorektal cancer.
Bortsett från den underliggande genetiska förändringen är det platsen för den genetiska lesionen som skiljer modeller av sporadisk och syndromal kolorektal cancer. Samtliga ovannämnda modeller har mutationer som är konstitutivt aktiva eller induceras genom hela tjocktarmen eller till och med hela mag-tarmkanalen. Detta resulterar i bildandet av flera adenomer, som inte är representativt för human sporadisk CRC, är knappast bedömbar genom koloskopi och dessutom lämnar vanligen inte tumörerna tillräckligt med tid att utvecklas innan djuret sänker sig till den omfattande tumörbelastningen. Därför måste en musmodell för sporadisk kolorektal cancer innefatta lokal aktivering av kolorektal tumörgenesen.
De tumörer som uppstår i den här presenterade GEMM är strikt begränsade till det kirurgiskt klämmda och adeno-cre-infekterade segmentetAv tjocktarmen. Detta resulterar i bildandet av en enda tumör som är lättillgänglig för detektering och övervakning genom koloskopi. Dessutom gör det distala läget tarmobstruktion en sen komplikation av tumörtillväxt, vilket gör att tumörerna kan utvecklas till invasiva och, beroende på genotypen, metastatisk karcinom innan djuret kräver eutanasi. En annan fördel med segmentinfektion är den opåverkade miljön. Medan Apc Min och andra ärftliga musmodeller har den omgivande slemhinnan och även stromacellerna, drabbas de samma genetiska avvikelserna som tumörerna, utvecklar tumörerna i den här föreslagna modellen inom normalt kolonepitel och stroma. Detta möjliggör mer realistisk tumör-värd interaktion och molekylära studier utan begränsningar. Vidare är tidpunkten för tumörinduktion väldefinierad i denna modell. Medan Apc Min- musen utvecklas utvecklas tumörer efter "andra träffen", under vilken den andra Apc-allelen är stochastIcally förlorad vid en slumpmässig tidpunkt aktiveras alla önskade mutationer samtidigt i den här beskrivna modellen, vilket möjliggör sålunda studier av mycket tidiga lesioner eller konsekutiva biopsier på ett mycket definierat sätt.
Men denna modell kommer också med begränsningar. Korsningen av flera alleler i en modell kräver enorm tid och resurser; Dessutom kan ofta inte alla avkommor användas för experimenten på grund av en olämplig genotyp. Förfarandet själv kräver övning och är tidskrävande. Produktionen av adeno-cre virus suspension med tillräckligt höga titrar och i stora mängder är kostnadskrävande. Därför är denna modell inte lämplig att ersätta alla andra CRC-musmodeller och kommer att vara begränsad till laboratorier med ett tydligt fokus på GEM-modeller.
Själva protokollet är tekniskt krävande, men med viss utbildning kan icke-kirurgisk personal utföra förfarandena på ett adekvat sätt. Det kritiska steget under adeno-cre iNfection är inflationen i det klämda tarmsegmentet - överskott av intraluminalt tryck leder till perforering, otillräckligt tryck minskar graden av framgångsrik infektion. Detta steg kräver träning.
Ett protokoll för adenovirusinfektion i den distala kolon har publicerats av Hung et al. innan. 13 Det här presenterade protokollet skiljer sig från det ovannämnda protokollet i flera viktiga aspekter. Eftersom det ofta orsakar tarmperforering i oerfarna händer hoppas mekanisk nötning av slemhinnan före adeno-cre-inkubation i föreliggande protokoll. Detta resulterar i en reducerad hastighet av tumörbildning, som emellertid kan motverkas av ökade viraltitrar. På detta sätt kan mängden mesenkymala tumörer också minskas, eftersom utan mukosal abrasion mindre mesenkymala celler i tarmväggen utsätts för adeno-cre.
Också i motsats till ovan nämnda protokoll 13 härBeskrivet protokoll rekommenderar inte natten över fasta före operation eller koloskopi. Istället, rodnad i tarmen eller, vid koloskopi, används enkel mekanisk manipulation för att avlägsna kvarvarande fekal materia. Denna förfining av protokollet förbättrar djurskyddet dramatiskt. Övernattning är ett mycket stressfullt förfarande för små gnagare och är känt att kraftigt påverka den murina metabolismen, vilket också påverkar experimentella resultat. 24 , 25 Dessa oönskade effekter av natten fasta kan undvikas i det här presenterade manuskriptet.
En annan viktig skillnad mellan det här presenterade protokollet och protokollet av Hung et al. Är längden på det klämda segmentet (och sålunda infekterat). Medan det här beskrivna protokollet rekommenderar en kort längd (~ 3 mm), har Hung et al. Rekommendera 20 mm av den distala kolon som ska infekteras. Den kortare segmentlängden har valts för att minska antaletAv rekombinerade kryptor och därmed resulterande tumörer. Eftersom majoriteten av patienter med sporadisk CRC utvecklar en enda tumör snarare än flera tumörer, ökar denna åtgärd den kliniska relevansen av modellen. Tumörbildningshastigheten verkar inte påverkas av den reducerade ytan av infekterad tjocktarm.
Framtida tillämpningar av denna teknik inkluderar alla protokoll som kräver lokal re-rekombination i kolon slemhinnan. De flesta tillämpningar inom cancerforskning kommer att innefatta villkorliga onkogener, vilket leder till bildandet av kolorektala tumörer. Emellertid kan alla andra applikationer såsom inducerande reporterkonstruktioner inom kolon slemhinnan uppnås med det här presenterade protokollet också.
Sammanfattningsvis ger den här presenterade kombinationen av en mycket sofistikerad genmodifierad musmodell av kolorektal cancer tillsammans med möjligheten till kolonoskopi med hög upplösning för detektering och övervakning av de utvecklande tumörerna att tillhandahållaS en utmärkt inställning för att studera biologi och behandling av CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete är tillägnad minnet av professor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
