JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Published: August 11, 2017
doi:
10.3791/55957
, ,
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital,Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences,Utrecht University

Summary

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Abstract

הנדסת רקמות vascularized בונה, organoids היה מאתגר מבחינה היסטורית. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על microfluidic bioprinting כדי להפיק לפיגום עם multilayer השזירה הידרוג הסיבים. כדי להשיג חלקים bioprinting, ראש ההדפסה microfluidic הליבה-נדן המכיל ניסוח bioink ללא הפרדות צבע extruded מן הזרם הליבה והפתרון crosslinking נישא על ידי הזרם נדן, היה מתוכנן ולהכניסם אל bioprinter. על ידי מיזוג ג’לטין methacryloyl (GelMA) עם קילוף פלסטיצידיות, רב-סוכר זה עובר מיידי crosslinking יוניים רכוש בחר יונים כלט, ואחריו photocrosslinking משנית של הרכיב GelMA כדי להשיג מייצב קבוע, לפיגום microfibrous יכולה להיות מושגת באמצעות אסטרטגיה זו bioprinting. חשוב לציין, תאי אנדותל אנקפסולציה בתוך הסיבים bioprinted יכולים ליצור את לומן-מבני הדומה את להערכת במרוצת של תרבות במשך 16 ימים. לגרדום endothelialized microfibrous ניתן להשתמש בהמשך כדי לבנות רקמה vascularized דרך זריעה עוקבות של סוג משני תאים לתוך מרחב ביניים של הסיבים כמו מצע כלי הדם. Microfluidic bioprinting מספקת אסטרטגיה כללית בהנדסה נוח של רקמות vascularized-דיוק גבוה.

Introduction

. מטרות הנדסת רקמות כדי ליצור תחליפי רקמה תפקודית זה יכול לשמש כדי להחליף, לשחזר או להגדיל האלה פצוע או חולה גוף האדם1,2,3,4, לעיתים קרובות באמצעות שילוב של סוגי התאים הרצויים, מולקולות ביו5,6ו-9,8,7,biomaterials10 לאחרונה, טכנולוגיות הנדסת רקמות גם יותר ויותר שאומצו ליצירת במבחנה רקמות איברים דגמים המחקים את פונקציות חשובות של מקביליהם ויוו , עבור יישומים כגון פיתוח תרופות, החלפת קונבנציונאלי תא מישורי יתר מפושטת תרבויות11,12,13,14,15,16,17,18,19. בשני המצבים, יכולת לסכם את המיקרו-ארכיטקטורה מורכבת ואת המבנה ההירארכי של רקמות אנושיות הוא קריטי הפעלת פונקציונליות של רקמות מהונדסים10, בפרט, דרכים לשלב רשת כלי הדם לתוך רקמות מהונדסים הביקוש מאז vascularization מציג את אחד האתגרים הגדולים ביותר עד22,2321,20,שדה.

עד כה, מגוון רחב של גישות פותחו בהקשר זה, בניסיון לבנות מבנים כלי דם לתוך רקמות מהונדסים בונה עם דרגות שונות של הצלחה8. לדוגמה, הרכבה עצמית של תאי אנדותל מאפשר לדור של רשתות microvascular24; משלוח של גורמי גדילה אנגיוגנזה המניע מתמשכת כורוידאלית25,26; שימוש ובתאים וסקולרית ומקל pericytes תא אנדותל הצמיחה ואת מכלול24,27; עיצוב מאפיינים לגרדום מאפשר אפנון מדויק של28,vascularization29; תא גליון הטכנולוגיה מאפשרת תמרון נוח של כלי הדם בשכבות30. ובכל זאת, אסטרטגיות אלו לא להעניק את יכולת השליטה של המתבנת המרחבי של להערכת, המוביל לעיתים קרובות הפצה אקראית של כלי דם בתוך מבנה רקמות מהונדסים ובכך הפארמצבטית מוגבלת. במהלך השנים האחרונות התפתחה bioprinting מחלקה של הפעלת טכנולוגיות לקראת הפתרון של אתגר כזה, בשל שלהם צדדיות ללא תחרות של הפקדת רקמות מורכבות דפוסי דיוק גבוה, הפארמצבטית ב32,31,33צורה אוטומטית או חצי אוטומטית. Bioprinting ההקרבה34,35,36,37,38, bioprinting מוטבע-39,–40,–41, מבנה חלול bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 יש כל מה הפגינו את הכדאיות של יצירת רקמות לכלי הדם או vascularized.

לחלופין, אסטרטגיה bioprinting microfluidic לפברק פיגומים microfibrous פותחו לאחרונה, bioink היברידית המורכב alginate ואיפה ג’לטין methacryloyl (GelMA) הועבר דרך הליבה של אביזרים קונצנטריים פתרון סידן כלורי (2CaCl) בוצעה דרך הזרימה נדן החיצוני של54,ראש ההדפסה55. ההבלטה שיתוף של תזרימי שני המותר עבור crosslinking הפיזית המיידית של הרכיב alginate כדי לאפשר היווצרות מיקרופייבר, בעוד photocrosslinking הבאים הבטיחו קבוע ייצוב לגרדום microfibrous רב-שכבתית. ראוי לציין, תאי אנדותל אנקפסולציה בתוך הסיבים bioprinted נמצאו להתרבות ולהעביר לכיוון פריפריה של הסיבים בהנחה מבנים דמויי-לומן, זה ממש מחקה את המיטה וסקולרית54,55. Bioprinted אלו, endothelialized מיטות נימי הדם יכול להיות לאחר מכן מאוכלס עם הצורך סוגי תאים משנית נוספת לבנות רקמות vascularized55. פרוטוקול זה ובכך מספק הליך מפורט של כזה microfluidic bioprinting אסטרטגיה מופעלת על ידי עיצוב קונצנטריים זרבובית, המבטיח נוח פבריקציה נוספת של רקמות vascularized עבור יישומים פוטנציאליים הנדסת רקמות והן תא צורב דוגמנות.

Protocol

Cardiomyocytes עכברוש neonatal בשימוש פרוטוקול זה הם בודדו אותנו מהמתרחש חולדות ספראג-Dawley בן יום-2 בעקבות הליך ומבוססת56 אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד לשימוש בריגהם אנד וימנס. 1. אינסטרומנטציה של Bioprinter להוסיף מחט בוטה קטנים יותר (למשל, 27 גרם, 1 אינץ ‘) כמ?…

Representative Results

האסטרטגיה bioprinting microfluidic מאפשר bioprinting ישירה ההבלטה של פיגומים microfibrous באמצעות צמיגות נמוכה bioinks54,55. כפי שמוצג באיור 2א, לפיגום בגודל של 6 × 6 × 6 מ מ3 המכיל > 30 שכבות של הסיבים יכול להיות bioprinted בתוך 10 דקות. Crosslinking י…

Discussion

בניית ראש ההדפסה co-צירית מייצג צעד קריטי לקראת bioprinting microfluidic מוצלח כדי לאפשר משלוח בו זמנית של שתי bioink הליבה והסוכנת crosslinking מהנדן. בעוד פרוטוקול זה ראש ההדפסה דוגמה נוצר באמצעות מחט 27G וגם הליבה של מחט 18 גרם כמו המעטפת, זה ברצון יורחב למגוון רחב של שילובים באמצעות מחטים בגדלים שונים. עם זאת, ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים להכיר המכון הלאומי לסרטן של מוסדות לאומיים של בריאות מסלול העצמאות פרס (K99CA201603).

Materials

Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in Tissue Engineering. Sci. Am. 300 (5), 64-71 (2009).
  3. Langer, R. Tissue Engineering: Status and Challenges. E-Biomed: J.Regen. Med. 1 (1), 5-6 (2004).
  4. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering Complex Tissues. Sci. Transl. Med. 4 (160), 112 (2012).
  5. Biondi, M., Ungaro, F., Quaglia, F., Netti, P. A. Controlled Drug Delivery in Tissue Engineering. Adv. Drug Del. Rev. 60 (2), 229-242 (2008).
  6. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled Growth Factor Delivery for Tissue Engineering. Adv. Mater. 21 (32-33), 3269-3285 (2009).
  7. Hubbell, J. A. Biomaterials in Tissue Engineering. Nat. Biotechnol. 13 (6), 565-576 (1995).
  8. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in Biomaterials for Tissue Engineering. Nat. Mater. 8 (6), 457-470 (2009).
  9. Rice, J. J., et al. Engineering the Regenerative Microenvironment with Biomaterials. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 57-71 (2012).
  10. Zhang, Y. S., Xia, Y. Multiple Facets for Extracellular Matrix Mimicking in Regenerative Medicine. Nanomedicine. 10 (5), 689-692 (2015).
  11. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  12. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic Organs-on-Chips. Nat. Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-Chips at the Frontiers of Drug Discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Seeking the Right Context for Evaluating Nanomedicine: From Tissue Models in Petri Dishes to Microfluidic Organs-on-a-Chip. Nanomedicine. 10, 685-688 (2015).
  15. Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., Van Noort, D., Yu, H. Towards a Human-on-Chip: Culturing Multiple Cell Types on a Chip with Compartmentalized Microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
  16. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  17. Sung, J. H., et al. Microfabricated Mammalian Organ Systems and Their Integration into Models of Whole Animals and Humans. Lab Chip. 13 (7), 1201-1212 (2013).
  18. Wikswo, J. P. The Relevance and Potential Roles of Microphysiological Systems in Biology and Medicine. Exp. Biol. Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  19. Yum, K., Hong, S. G., Healy, K. E., Lee, L. P. Physiologically Relevant Organs on Chips. Biotechnol. J. 9 (1), 16-27 (2014).
  20. Nomi, M., Atala, A., Coppi, P. D., Soker, S. Principals of Neovascularization for Tissue Engineering. Mol. Aspects Med. 23 (6), 463-483 (2002).
  21. Jain, R. K., Au, P., Tam, J., Duda, D. G., Fukumura, D. Engineering Vascularized Tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 821-823 (2005).
  22. Rouwkema, J., Rivron, N. C., Van Blitterswijk, C. A. Vascularization in Tissue Engineering. Trends Biotechnol. 26 (8), 434-441 (2008).
  23. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Sci. Transl. Med. 4 (160), 123 (2012).
  24. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  25. Perets, A., et al. Enhancing the Vascularization of Three-Dimensional Porous Alginate Scaffolds by Incorporating Controlled Release Basic Fibroblast Growth Factor Microspheres. J. Biomed. Mater. Res. A. 65 (4), 489-497 (2003).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining Neovascularization of a Scaffold through Staged Release of Vascular Endothelial Growth Factor-A and Platelet-Derived Growth Factor-BB. Tissue Eng. A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of Adult Mesenchymal Stem Cells on in Vitro Vascular Formation. Tissue Eng. A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  28. Quint, C., et al. Decellularized Tissue-Engineered Blood Vessel as an Arterial Conduit. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  29. Choi, S. -. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in Biodegradable Inverse Opal Scaffolds with Uniform and Precisely Controlled Pore Sizes. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 145-154 (2013).
  30. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of Three-Dimensional Vascularized Cardiac Tissue with Cell Sheet Engineering. J. Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  31. Zhang, Y. S., et al. 3D Bioprinting for Tissue and Organ Fabrication. Ann. Biomed. Eng. 45 (1), 148-163 (2017).
  32. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv. Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  33. Murphy, S. V., Atala, A. 3d Bioprinting of Tissues and Organs. Nat. Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  34. Miller, J. S., et al. Rapid Casting of Patterned Vascular Networks for Perfusable Engineered Three-Dimensional Tissues. Nat. Mater. 11 (9), 768-774 (2012).
  35. Bertassoni, L. E., et al. Hydrogel Bioprinted Microchannel Networks for Vascularization of Tissue Engineering Constructs. Lab Chip. 14 (13), 2202-2211 (2014).
  36. Kolesky, D. B., et al. 3d Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  37. Lee, V. K., et al. Creating Perfused Functional Vascular Channels Using 3d Bio-Printing Technology. Biomaterials. 35 (28), 8092-8102 (2014).
  38. Zhang, Y. S., et al. Bioprinted Thrombosis-on-a-Chip. Lab Chip. 16, 4097-4105 (2016).
  39. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the Granular Gel Medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  40. Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3d Printing of Shear-Thinning Hydrogels into Self-Healing Hydrogels. Adv. Mater. 27 (34), 5075-5079 (2015).
  41. Hinton, T. J., et al. Three-Dimensional Printing of Complex Biological Structures by Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  42. Jia, W., et al. Direct 3d Bioprinting of Perfusable Vascular Constructs Using a Blend Bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  43. Zhang, Y., et al. In Vitro Study of Directly Bioprinted Perfusable Vasculature Conduits. Biomaterials Science. 3 (1), 134-143 (2015).
  44. Gao, Q., He, Y., Fu, J. -. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial Nozzle-Assisted 3D Bioprinting with Built-in Microchannels for Nutrients Delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  45. Cornock, R., Beirne, S., Thompson, B., Wallace, G. G. Coaxial Additive Manufacture of Biomaterial Composite Scaffolds for Tissue Engineering. Biofabrication. 6 (2), 025002 (2014).
  46. Duan, B., Hockaday, L. A., Kang, K. H., Butcher, J. T. 3D Bioprinting of Heterogeneous Aortic Valve Conduits with Alginate/Gelatin Hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. A. 101 (5), 1255-1264 (2013).
  47. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable Hyaluronan-Gelatin Hydrogels for Two-Step Bioprinting. Tissue Eng. A. 16 (8), 2675-2685 (2010).
  48. Li, S., et al. Direct Fabrication of a Hybrid Cell/Hydrogel Construct by a Double-Nozzle Assembling Technology. J. Bioact. Compatible Polym. 24 (3), 249-265 (2009).
  49. Visser, J., et al. Biofabrication of Multi-Material Anatomically Shaped Tissue Constructs. Biofabrication. 5 (3), 035007 (2013).
  50. Boyd, D. A., Adams, A. A., Daniele, M. A., Ligler, F. S. Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape. Journal of visualized experiments: JoVE. (83), e50958 (2014).
  51. Daniele, M. A., Adams, A. A., Naciri, J., North, S. H., Ligler, F. S. Interpenetrating Networks Based on Gelatin Methacrylamide and Peg Formed Using Concurrent Thiol Click Chemistries for Hydrogel Tissue Engineering Scaffolds. Biomaterials. 35 (6), 1845-1856 (2014).
  52. Daniele, M. A., Boyd, D. A., Adams, A. A., Ligler, F. S. Microfluidic Strategies for Design and Assembly of Microfibers and Nanofibers with Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications. Adv. Healthcare Mater. 4 (1), 11-28 (2015).
  53. Daniele, M. A., Radom, K., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfluidic Fabrication of Multiaxial Microvessels Via Hydrodynamic Shaping. RSC Advances. 4 (45), 23440-23446 (2014).
  54. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low Viscosity Bioink. Adv. Mater. 28 (4), 677-684 (2015).
  55. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D Microfibrous Scaffolds for Engineering Endothelialized Myocardium and Heart-on-a-Chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
  56. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic Patterning for Fabrication of Contractile Cardiac Organoids. Biomed. Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  57. Yue, K., et al. Synthesis, Properties, and Biomedical Applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  58. Loessner, D., et al. Functionalization, Preparation and Use of Cell-Laden Gelatin Methacryloyl-Based Hydrogels as Modular Tissue Culture Platforms. Nat. Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  59. Aung, A., Theprungsirikul, J., Lim, H. L., Varghese, S. Chemotaxis-Driven Assembly of Endothelial Barrier in a Tumor-on-a-Chip Platform. Lab Chip. 16, 1886-1898 (2016).
  60. Shin, S. R., et al. A Bioactive Carbon Nanotube-Based Ink for Printing 2d and 3d Flexible Electronics. Adv. Mater. 28 (17), 3280-3289 (2016).
  61. Shin, S. R., et al. Aptamer-Based Microfluidic Electrochemical Biosensor for Monitoring Cell Secreted Cardiac Biomarkers. Anal. Chem. 88, 10019-10027 (2016).
  62. Zhang, Y. S., et al. Google Glass-Directed Monitoring and Control of Microfluidic Biosensors and Actuators. Sci. Rep. 6, 22237 (2016).
  63. Colosi, C., et al. Rapid Prototyping of Chitosan-Coated Alginate Scaffolds through the Use of a 3d Fiber Deposition Technique. J. Mater. Chem. B. 2 (39), 6779-6791 (2014).
  64. Zhu, W., et al. Direct 3D Bioprinting of Prevascularized Tissue Constructs with Complex Microarchitecture. Biomaterials. 124, 106-115 (2017).
  65. Yu, Y., Zhang, Y., Martin, J. A., Ozbolat, I. T. Evaluation of Cell Viability and Functionality in Vessel-Like Bioprintable Cell-Laden Tubular Channels. J. Biomech. Eng. 135 (9), 091011-091011 (2013).
  66. Zhang, Y., Yu, Y., Chen, H., Ozbolat, I. T. Characterization of Printable Cellular Micro-Fluidic Channels for Tissue Engineering. Biofabrication. 5 (2), 025004 (2013).
  67. Zhang, Y., Yu, Y., Ozbolat, I. T. Direct Bioprinting of Vessel-Like Tubular Microfluidic Channels. J. Nanotechnol. Eng. Med. 4 (2), 020902 (2013).
  68. Dolati, F., et al. In Vitro Evaluation of Carbon-Nanotube-Reinforced Bioprintable Vascular Conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  69. Hansen, C. J., et al. High-Throughput Printing Via Microvascular Multinozzle Arrays. Adv. Mater. 25 (1), 96-102 (2013).

Tags

Microfluidic BioprintingOrganoidsVascular VatLiverSkinCancerBioprinterAlginateGelMAPhotoinitiatorHEPES BufferFBSCalcium ChlorideHUVECsDual Channel Syringe PumpCrosslinking
check_url/55957?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image