מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות
Summary
אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.
Abstract
דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא טכניקה חזקה לכימות תנועת תרמודינמי פרמטרים הנוגעים למערכות ביולוגיות קיפול ואינטראקציות מחייב. מידע זה חיוני בעיצוב של תרכובות פרמצבטיות חדש. אולם, רבים ליגנדים הרלוונטיים הם הם לא יציב מבחינה כימית בטמפרטורות גבוהות בשימוש DSC ניתוחים. לפיכך, מדידת אינטראקציות מחייב הוא מאתגר כי הריכוזים של ליגנדים ומוצרים המרה תרמית משתנים ללא הרף בתוך התא קלורימטר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות ליגנדים thermolabile ו DSC להשגת במהירות מידע תרמודינמי קינטי קיפול, האיגוד, לבין ליגנד תהליכי ההמרה. אנחנו החלת שיטת שלנו aptamer ה-DNA MN4 המאגד הקוקאין ליגנד thermolabile. באמצעות ניתוח כללי התאמה חדשים that חשבונות for ליגנד thermolabile ההמרה, הערכה המלאה של קיפול ופרמטרים איגוד מתקבלים מן זוג ניסויים DSC. בנוסף, נראה כי ניתן להשיג את קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile עם dataset DSC משלים אחד בלבד. ההנחיות לזיהוי וניתוח נתונים של מספר תרחישים יותר מסובך מוצגים, כולל צבירת בלתי הפיך של biomolecule, קיפול איטי, איגוד איטי, דלדול מהירה ליגנד thermolabile.
Introduction
דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא שיטה חזקה עבור איגוד למערכות ביולוגיות quantitating ומתקפלים אינטראקציות1,2,3. נקודות החוזק של DSC כוללים את יכולתו להבהיר מחייב וקיפול מנגנונים, תשואה של2,המקביל פרמטרים תרמודינמי3. יתר על כן, DSC יכול להתבצע בפתרון בתנאים ליד-פיזיולוגיים, לא דורשת תיוג של biomolecule או ליגנד, למשל, עם fluorophores, ספין-תוויות או גרעינית איזוטופים4. המכשיר סורק בטמפרטורה, מודדים את כמות החום הדרושה כדי denature את biomolecule, הנוכחות ואת היעדר ליגנד. Thermograms שנוצר משמשים כדי לחלץ את הפרמטרים תרמודינמי המסדירים את ליגנד מחייב וקיפול תהליכים. המידע שנמסר על ידי DSC או בטכניקות אחרות תרמודינמי חיוני המנחה את העיצוב של שהתרופות המתוות מולקולות1,5,6,7,8. עם זאת, סריקה חוזרת ונשנית לטמפרטורות גבוהות (~ 60-100 ° C) יכול להיות בעייתי. לדוגמה, תרכובות הם חשובים רבים עוברים סידור או ריקבון על חשיפה מתמשכת בטמפרטורות גבוהות9,10,11, קרי, הם thermolabile. בחינה של איגוד אינטראקציות על ידי DSC בדרך כלל דורש מספר סריקות ואחורה כדי לאמת את הפארמצבטית של תמוגרפיה ניתוח תרמודינמי12. המרה תרמי של ליגנד הראשונית בטופס משני עם איגוד שינו מאפיינים מוביל בולטת הבדלים הצורה והמיקום של thermograms רצופות, מאז ריכוז ליגנד הראשונית יורדת עם כל סריקה בזמן ההמרה התרמית מוצרים לצבור. אלה נתונים (datasets) נתונות לא ניתוח מסורתי.
לאחרונה פיתחנו שיטת המדידה הכללית datasets ליגנד thermolabile DSC המניבה את הערכה המלאה של פרמטרים תרמודינמי המסדירים את הקיפולים למערכות ביולוגיות ואיגוד אינטראקציות של ניסוי מאוגד-ליגנד אחד הפניה תמוגרפיה כנדרש עבור חינם biomolecule4. הניתוח מקטין את זמן הניסוי ואת מדגם הנדרש על-ידי ~ 10-fold בהשוואה הגישות DSC סטנדרטי. יש לנו פיתרון ליגנד ההמרה התרמית שייטול את זה קורה במהלך החלק בטמפרטורה גבוהה של כל סריקה איפה תמוגרפיה אינו תלוי בריכוז ליגנד. לכן, ריכוז ליגנד הוא קבוע בתוך החלק של תמוגרפיה המשמש כדי לחלץ תרמודינמי פרמטרים. בנוסף להדגים איך קצב קבוע לגיור תרמי ליגנד יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע ניסוי משלים אחד עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה. עבור מערכות ההמרה התרמית ליגנד איפה פחות תלוית טמפרטורה (קרי, המתרחשים ניכרת בטמפרטורות כל), הניתוח יכול להיות שונה כדי לכלול ריכוזים ליגנד משתנה. כאן אנחנו מוכיחים את הליך זה עבור aptamer DNA MN4 בנוכחות הקוקאין ליגנד thermolabile, אשר ממירה במהירות benzoylecgonine בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C). כינין משמש פקד שלילי ליגנד thermolability כיוון שהוא אינו עובר המרה בטמפרטורות אלה ניסיוני נקשר גם MN4. אנו מתארים הרכישה של ליגנד thermolabile DSC datasets וניתוח שלהם מניב פרמטרים תרמודינמי, קינטי של קיפול, איגוד, ליגנד תהליכי ההמרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים ופתרון בעיות
הפרטים של הניתוח התאמה העולמית בשימוש איור 1 , איור 2 היה שתואר לעיל4. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ההיבטים המעשיים של ביצוע וניתוח DSC מחייב בין ניסויים ליגנדים thermolabile. שימו לב כי תוכנית בסיסית DSC להשיג עבור ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V ח וו ר נתמכה על ידי מדעי הטבע מקגיל תוכנית אימונים הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ב- Bionanomachines. א ק מ ופי אי ג’יי נתמכו על ידי מענקים NSERC 327028-09 (א ק ז), 238562 (פי אי ג’יי).
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
