Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen
Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für schnelle Charakterisierung der biomolekularen Faltung und Interaktionen mit thermolabilen Liganden mit differential scanning Kalorimetrie verbindlich.
Abstract
Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Quantifizierung der thermodynamischen Parameter für biomolekulare Falt- und bindender Wechselwirkungen. Diese Information ist entscheidend bei der Gestaltung neuer Arzneimittel zur Behandlung. Allerdings sind viele pharmazeutisch relevante Liganden chemisch instabil bei den hohen Temperaturen im DSC-Analysen verwendet. So messen bindender Wechselwirkungen wird schwierig, da die Konzentrationen von Liganden und thermisch umgewandelt Produkte innerhalb der Kalorimeter Zelle ständig in Bewegung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit thermolabilen Liganden und DSC für schnell Informationsbeschaffung thermodynamischen und kinetischen auf die Falten, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse. Wir haben unsere Methode auf die DNA-Aptamer MN4 angewandt, die das Kokain thermolabilen Liganden bindet. Verwenden eine neue globale Fitting-Analyse, die Konten für thermolabile Liganden Umwandlung, die Gesamtheit der Faltung und Bindungsparameter stammen aus ein paar DSC Experimente. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Geschwindigkeitskonstante für thermolabile Liganden Konvertierung mit nur einem zusätzlichen DSC Dataset bezogen werden kann. Die Leitlinien für die Identifizierung und Analyse von Daten aus mehreren komplizierter Szenarien werden vorgestellt, einschließlich irreversible Aggregation der Biomolekül, langsam Falten, langsame verbindliche und schnelle Entleerung des thermolabilen Liganden.
Introduction
Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung biomolekularen Bindung und faltende Wechselwirkungen1,2,3. Die Stärken der DSC gehören seine Fähigkeit zur Bindung und Falten Mechanismen aufzuklären und zu der entsprechenden thermodynamischen Parameter2,3. Darüber hinaus DSC kann in Lösung in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und erfordert keine Kennzeichnung der Biomolekül oder Liganden, z. B.mit Fluorophore, Spin-Etiketten oder nuklearen Isotope4. Das Gerät scannt in Temperatur, Messung der Menge an Wärme benötigt, um das Biomolekül in an- und Abwesenheit des Liganden zu denaturieren. Die daraus resultierende Thermogramme werden verwendet, um die thermodynamischen Parameter den Liganden binden und Faltung Prozesse zu extrahieren. DSC oder anderen thermodynamischen Verfahren übermittelten Informationen ist entscheidend für die Führung der Gestaltung der Medikamente gegen Biomoleküle1,5,6,7,8. Jedoch das wiederholte Scannen zu hohen Temperaturen (~ 60-100 ° C) kann problematisch sein. Zum Beispiel viele pharmazeutisch wichtige Verbindungen zu unterziehen, Rearrangement oder Zersetzung auf anhaltende Exposition gegenüber hohen Temperaturen9,10,11, d. h., sie sind thermolabilen. Prüfung von verbindlichen Interaktionen von DSC in der Regel erfordert Mehrfachscans vorwärts und rückwärts um die Reproduzierbarkeit der Thermogramm für thermodynamische Analysen12zu überprüfen. Thermische Umwandlung von einer anfänglichen Liganden an einen sekundären Formen mit veränderten Bindungseigenschaften führt zu ausgeprägten Unterschiede in Form und Position der aufeinanderfolgenden Thermogramme, da verringert sich die Konzentration des ersten Liganden mit jedem Scan während der thermische Umwandlungsprodukte ansammeln. Diese Datensätze sind nicht traditionelle Analysen zugänglich.
Vor kurzem haben wir eine globale Anpassungsmethode für thermolabile Liganden DSC-Datasets, die die Gesamtheit der thermodynamischen Parameter für die biomolekularen Faltung und bindende Wechselwirkungen aus einem einzigen Liganden gebundenes Experiment bezogen auf ergibt die erforderlichen Thermogramm für die kostenlose Biomolekül-4. Die Analyse reduziert den experimentellen Probe vorgeschriebenen ~ 10-fach im Vergleich zu standard-DSC-Ansätze. Wir haben entfielen für Liganden thermische Umwandlung von vorausgesetzt, dies geschieht während der Hochtemperatur-Teil für jeden Scan wo das Thermogramm nicht Liganden-Konzentration hängt. Daher ist die Liganden-Konzentration eine konstante innerhalb des Teils des Thermogramm, die verwendet wird, um thermodynamische Parameter zu extrahieren. Wir zusätzlich gezeigt, wie die Geschwindigkeitskonstante für Ligand thermische Umwandlung erreicht werden kann, durch eine ergänzende Experiment mit Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung länger ausführen. Für Systeme, wo Liganden thermische Umwandlung weniger temperaturabhängig (d.h.auftretenden spürbar bei allen Temperaturen), die Analyse kann geändert werden, um Variable Liganden Konzentrationen enthalten. Hier zeigen wir dieses Verfahren zur DNA-Aptamer MN4 in Anwesenheit von thermolabilen Liganden Kokain, die schnell zum Benzoylecgonin bei hohen Temperaturen Konvertiten (> 60 ° C). Chinin wird als Negativkontrolle für Liganden Thermolability verwendet, da es Konvertierung bei diesen experimentellen Temperaturen nicht unterziehen und auch an MN4 bindet. Wir beschreiben den Erwerb von thermolabilen Liganden DSC Datasets und ihre Analyse nachgeben thermodynamischen und kinetischen Parameter der Faltung, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifikationen und Fehlerbehebung
Die Details der globalen passende Analyse verwendet in Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden4beschrieben. Hier beschreiben wir die praktischen Aspekte der Durchführung und Analyse von DSC verbindliche Experimente mit thermolabilen Liganden. Beachten Sie, dass Basispläne DSC erhalten für thermolabile Liganden allein von den Liganden subtrahiert wird + Biomolekül…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. W. H. V wurde von der McGill Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) Schulungsprogramm in Bionanomachines unterstützt. A. K. M. und P. E. J. wurden von NSERC Zuschüsse 327028-09 (A. K. M) und 238562 (P. E. J.) unterstützt.
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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