애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법
Summary
이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
그들의 개발의 높은 예측 가능한 특성을 감안할 때, 애기 배아 사용 되었습니다 모델로 morphogenesis 식물에서의 연구에 대 한. 그러나, 초기 단계 공장 배아 작은 그리고 그들을 관찰 하 고 분석 어렵게 만드는 몇 가지 셀을 포함. 메서드는 특성화 모델 유기 체 애기를 사용 하 여 현미경으로 식물 배아에서 패턴 형성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. Hoyer의 솔루션을 사용 하 여 신선한 ovules의 정리, 다음에 휴대폰 번호와 배아의 형태 관찰 될 수 있었다, 그리고 그들의 발달 단계는 기름 침수 렌즈 X 100을 사용 하 여 미분 간섭 명암 현미경에 의해 결정 될 수 있었다. 또한, 특정 마커 단백질 녹색 형광 단백질 (GFP)와 태그의 표현 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 셀 id 사양 배아 패턴화 하는 동안 주석을 모니터링 했다. 따라서, 세포 및 분자 수준에서 야생-타입 식물 배아에서 패턴 형성을 관찰 하 고 야생-타입 식물 및 배아 치명적인 돌연변이 배아에서 패턴 형성을 비교 하 여 모방 하는 태아에서에서 특정 유전자의 역할을 특성화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 따라서 메서드는 애기에 embryogenesis 특성을 사용할 수 있습니다.
Introduction
Embryogenesis 높은 공장 개발에서 초기 이벤트입니다. 세포 분열 및 엄격한 유전자 제어1,2차별화 통해 zygote에서 성숙한 배아 형태. 애기 배아는 embryogenesis 동안 세포 분열의 순서 예상된 패턴3,4를 따르기 때문에 morphogenesis의 제어를 공부 하는 유용한 모델입니다. 그러나, 여러 셀에 하나를 포함 하는 애기 배아 관찰 하 고 분석에 너무 작습니다. 또한, 특정 유전자의 돌연변이 배아 치 사 율5, embryogenesis에서 그 유전자의 중요 한 역할을 나타내는 발생할 수 있습니다. 배아-치명적인 돌연변이에 패턴 형성의 특성 필수 유전자 배아 개발을 규제 하는 의하여 분자 메커니즘을 이해 하기 위한 기초를 제공 한다.
자세한 방법은 직접 현미경 관찰에 의해 모델 공장 애기 배아 패턴 형성 특성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. 방법은 난 클리어런스를 배아의 현미경 관찰에 의해 다음을 포함 한다. 배아-치명적인 돌연변이의 특성 또한 설명 되어 있습니다.
다른 발달 단계에서 배아의 형태 Hoyer의 솔루션6,7지운 ovules를 사용 하 여 현미경으로 직접 확인할 수 있습니다. 이러한 ovules 전시 높은 굴절률; 따라서, 메서드를 비운이 난 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경으로 관찰 한다 견본을 위해 특히 유리 하다.
또한, embryogenesis 동안 특정 셀 또는 셀 제한 된 수에 표현 되는 유전자 배아에서 세포를 식별 하기 위해 마커로 사용할 수 있습니다. 따라서, embryogenesis 동안 셀 id 사양 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 GFP 태그 마커 단백질의 식이 모니터링 하 여 주석 첨부 될 수 있습니다. 반대로, 그것이 embryogenesis 중 한 알 수 없는 기능 유전자-GFP 융해의 식 패턴을 관찰 배아 패턴화와 그 유전자의 표현 사이의 링크를 제공를 애기에 embryogenesis에 필요한 새로운 유전자의 식별을 용이 하 게 됩니다.
여기 설명 하는 방법을 사용할 수 있습니다 또한 배아 치명적인 돌연변이의 표현 형을 특성화 하 고 세포 수준에서 embryogenesis에 영향을 받는 유전자의 영향을 확인 하. 또한, 함께 비교 마커 유전자의 표현 패턴의 야생 형 및 돌연변이 식물 사이 embryogenesis 동안, 방법은 분자 메커니즘 및 신호 경로 embryogenesis8,9에 참여에 대 한 단서를 얻을 수 있습니다. 실제로, 메서드 naa10 식물에 적용 된 그리고 그것은 돌연변이에 hypophysis의 비정상적인 부문 변화 embryogenesis5동안 auxin 배포에 의해 발생할 수 있습니다 발견 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
난 클리어런스는 세포 분열을 감지 하 고 애기;에서 embryogenesis 동안 형태를 평가 하는 유용한 방법 이 기술을 사용 하 여, 배아 DIC 현미경5,12에서 직접 관찰할 수 있습니다. 난 정리를 위한 중요 한 단계는 단계 1.3.4. 1.3.4 단계에서 난 허가에 필요한 시간은 변수입니다. 2/4-셀 단계에서 배아 Hoyer의 솔루션에서 2 시간 후 그들은 불명료 한 후 12 h 보이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비판적으로 원고 읽기 위한 박사 제시카 Habashi 감사 합니다. 우리 DR5 GFP 분석 결과의 지역화를 수행 하기 위한 이미징 센터,의 생명 과학, 수도 사범 대학 (베이징, 중국), 대학 박사 Xianyong Sheng을 감사 합니다. 이 작품은 베이징 시 정부 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CIT & TCD20150102) 국가 자연 과학 재단의 중국 (31600248)에서.
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
References
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