Описан ячеечная модель культуры сопротивления артерий, позволяя для рассечения сигнальные пути в эндотелия, гладких мышц, или между эндотелия и гладкой мускулатуры (myoendothelial-Джанкшн). Избирательное применение агонистов или белка изоляции, электронной микроскопии, иммунофлюоресценции могут быть использованы с помощью этой модели культуры клеток.
Myoendothelial соединения (меж), уникальный сигнализации microdomain в артериях сопротивления малого диаметра, экспонаты локализации специфических белков и сигнальных процессов, которые можно контролировать тонус сосудов и кровяного давления. Как это проекция либо из клеток эндотелия и гладкой мускулатуры и из-за его небольшой размер (в среднем, площадь ~ 1 мкм2), меж трудно изучать в изоляции. Однако мы разработали модель культуры клеток называется Сопредседатель культуры клеток сосудистой (VCCC), которая позволяет в vitro меж формирования, эндотелиальных клеток поляризации и рассечение сигнализации белков и процессов в стенке сосудистого сопротивления артерии. VCCC имеет множество приложений и могут быть адаптированы с учетом различных типов клеток. Модель состоит из двух типов клеток, выращиваемых на противоположных сторонах фильтра с 0,4 мкм поры, в которые в пробирке MEJs могут образовывать. Здесь мы опишем, как для создания VCCC через покрытие клеток и изоляции эндотелия, меж и гладких мышц фракции, которые затем могут быть использованы для изоляции белка или деятельность анализов. Фильтр с нетронутым клеток слои могут устанавливаться, встраиваемых и секционного для immunofluorescent анализа. Важно отметить, что многие из открытий от этой модели были подтверждены с помощью нетронутыми сопротивления артерий, подчеркивая ее физиологической значимости.
В артериях сопротивления малого диаметра тонкой внутренней упругой пластинки (IEL) отделяет эндотелия (ЕК) и гладкомышечные клетки (SMC). Клетки могут проекта через отверстия в этом эластичной матрице и устанавливают прямые соединения цитоплазматических через разрыв соединения каналы1,2. Эта уникальная структура называется перекрестка myoendothelial (меж). МЕЖ-это небольшой (примерно 0,5 мкм x 0,5 мкм, в зависимости от сосудистого русла), сотовой проекция состоит преимущественно из эндотелиальных клеток, но могут происходить из гладких мышц, а также3,4. Ряд исследователей продемонстрировали огромную сложность сигнальной сети, которые происходят выборочно на меж, делает его особенно важное место для содействия двунаправленной передачи сигналов между эндотелия и гладкой мускулатуры5 ,6,,78,9,10.
Однако механистических рассечение сигнальных путей на меж трудно в артерии, нетронутыми. Потому что меж проекцию сотовый, это не возможно в настоящее время изолировать в vivo меж от сосудистой стенки. По этой причине была разработана модель VCCC1 . Важно отметить, что VCCC реплицирует физиологических эндотелиальной морфология11 и поляризации сигнализации между апикальной и меж части клетки12. Именно эта уникальная модель, которая облегчает открытие, альфа-гемоглобина в эндотелиальных клеток, поляризованных меж. Это в отличие от условно культивировали эндотелиальных клеток, которые не выражают альфа-гемоглобин13. Для исследователей, заинтересованных в микрососудистой эндотелия она может быть более целесообразно использовать эндотелиальных клеток, которые были культивировали в VCCC, особенно если цель состоит в том, чтобы вскрыть сигнальных путей, которые происходят в артериях сопротивления малого диаметра.
Использование прочные пластиковые вставки, содержащий фильтр с малого диаметра поры (0,4 мкм в диаметре) для совместного культуры двух типов различных клеток предотвращает клетки мигрируют между слоями. Это приводит к 10 мкм расстояние между клетками, которые значительно больше, чем в естественных условиях, но по-прежнему реплицирует многие из характеристик в vivo MEJs, включая локализация протеина и второй messenger сигнализации1 , 14. Кроме того, VCCC позволяет для ориентации клетки сигнализации через добавлением агонистов или антагонист конкретных клеточных отделения для конкретного типа. Например загрузка ЕК с BAPTA-AM в хелатной кальция и стимулирования РРХВ фенилэфрин14. В отличие от других описаний Сопредседатель культура модели15,16,,1718,19,20,21это обеспечивает Инструкция по изоляции отдельных фракций для мРНК и белков, включая собственный меж фракция в поры фильтра. Добавление этой методики VCCC позволяет для расследования конкретных изменений в мРНК локализации или транскрипции22, фосфорилирование белков12,23и активность белка12. Этой статье будет описано нанесение EC верхней части фильтра и SMC на дне, хотя возможна культура типы двух клеток в разных конформации11,18,24.
VCCC имеет ряд преимуществ с точки зрения изложив MEJs в пробирке, но есть точки обсуждения, при определении, если VCCC может использоваться для конкретного приложения. Например если различных типов клеток, которые будут использоваться с этой моделью, он будет нужно быть оптимизированы. …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана национальной сердца, легких и крови Институт предоставляет лектор стипендий 14PRE20420024 R01088554, T32HL007284 и Американской ассоциации сердца. Мы особенно благодарим Санкт Джуд сотовой Imaging общих исследований ядро, включая Рэндалл Уэйкфилд и Линда Хорнер для изображений, электронной микроскопии, Адам Straub для помощи с изображениями представитель иммунофлюоресценции и Pooneh Багер для нее ценную информацию о протоколе рукопись.
24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
225cm2 flask | Corning | 431082 | |
6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
50mL conical tube | Corning | 352070 | |
10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Embedding/Sectioning/Staining | |||
Paraffin | Fisher | P31-500 | |
Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |