En Cell kultur modell av motstånd artärer
Summary
En cell kultur modell av motstånd artärer beskrivs, vilket möjliggör dissektion av signalering vägar i endotel, glatt muskulatur, eller mellan endotel och glatt muskulatur (myoendothelial korsningen). Selektiv tillämpning av agonister eller protein isolering, elektronmikroskopi eller immunofluorescens kan utnyttjas med hjälp av denna cell kultur modell.
Abstract
Myoendothelial korsningen (MEJ), en unik signalering microdomain i liten diameter motstånd artärer, uppvisar lokalisering av specifika proteiner och signalering processer som kan styra kärltonus och blodtryck. Eftersom det är en projektion från antingen cellen endotelceller eller glatt muskulatur, och på grund av dess liten storlek (i genomsnitt, ett område med ~ 1 µm2), MEJ är svåra att studera i isolering. Vi har emellertid utvecklat en cell kultur modell som kallas vaskulär samtidig cellkulturen (VCCC) som möjliggör i vitro MEJ bildandet, endotelceller polarisering och dissektion av signalering proteiner och processer i kärlväggen av motstånd artärer. VCCC har en mängd applikationer och kan anpassas till olika celltyper. Modellen består av två typer av celler som odlas på motsatta sidor av ett filter med 0,4 µm porer där den i vitro MEJs kan bilda. Här beskriver vi hur du skapar VCCC via plätering av celler och isolering av endotelceller, MEJ, och glatt muskulatur fraktioner, som sedan kan användas för protein isolering eller aktiviteten analyser. Filtret med intakt cell lager kan vara fast, embedded och sektionerad för Immunofluorescerande analys. Många av upptäckterna från denna modell har allt bekräftats med intakt motstånd artärer, vilket understryker dess fysiologiska betydelse.
Introduction
I liten diameter motstånd artärer avskiljer en tunna intern elastisk lamina (IEL) endotelceller (EG) och glatta muskelceller (SMC). Cellerna kan projektet genom hål i denna elastiska matris och göra direkta cytoplasmiska anslutningar via gap junction kanaler1,2. Denna unika struktur som kallas myoendothelial korsningen (MEJ). MEJ är en liten (cirka 0,5 µm x 0,5 µm, beroende på vaskulär sängen), cellulär projektion består huvudsakligen av endothelial celler men kan härröra från glatt muskulatur samt3,4. Ett antal utredare har visat enorma komplexitet signalering nätverk som sker selektivt på det MEJ, gör den ett särskilt viktigt läge för att underlätta dubbelriktad signalering mellan endotel och glatt muskulatur5 ,6,7,8,9,10.
En mekanistisk dissekering av signalvägar vid MEJ är dock svårt i en intakt artär. Eftersom MEJ är en cellulär projektion, är det inte för närvarande möjligt att isolera en i vivo MEJ från kärlväggen. Därför utvecklades till VCCC modell1 . Ännu viktigare, VCCC replikerar fysiologiska endothelial morfologi11 och polarisering av signalering mellan den apikala och MEJ delar av cellen12. Det var denna unika modell som underlättat upptäckten att alfa hemoglobin är i endothelial cellen, polariserade till MEJ. Detta är i motsats till konventionellt odlade endotelceller som inte uttrycker alfa hemoglobin13. För forskares mikrovaskulära endotelet, kan det lämpligare att använda endotelceller som har varit odlade i VCCC, särskilt om avsikten är att dissekera signalvägar som förekommer i liten diameter motstånd artärer.
Med en robust plastinsats som innehåller ett filter med liten diameter porer (0,4 µm i diameter) till samtidig kultur två distinkta celltyper hindrar cellerna från att migrera mellan lager. Det resulterar i en 10 µm avståndet mellan cellerna, vilket är betydligt längre än i vivo, men fortfarande replikerar många egenskaper i vivo MEJs, inklusive protein lokalisering och andra messenger signalering1 , 14. VCCC kan dessutom för inriktning av cell typspecifika signalering via tillägg av en agonist eller antagonist till den specifika mobilfack. Till exempel lastning EG med BAPTA-AM till kelat kalcium och stimulera SMC med fenylefrin14. I motsats till andra beskrivningar av samtidig kultur modeller15,16,17,18,19,20,21ger detta instruktioner om isolera de olika fraktionerna för mRNA och protein, inklusive den distinkta MEJ fraktionen inom filter porerna. Tillägg av denna teknik till VCCC möjliggör specifika undersökningar av förändringar i mRNA lokalisering eller transkription22, protein fosforylering12,23och protein aktivitet12. Denna artikel kommer att beskriva plätering av EG ovanpå filtret och SMC på botten, även om det är möjligt att kultur de två celltyper i olika konformationer11,18,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
VCCC har ett antal fördelar i form av går igenom MEJs i vitro, men det finns diskussionspunkterna vid fastställandet av om VCCC kan utnyttjas för specifika program. Till exempel om olika celltyper ska användas med denna modell, kommer att det behöva optimeras. Vi har använt primära mänskliga celler men det är möjligt att isolera cellerna från nötkreatur artärer24eller vildtyp eller knockout möss, och använda dem i VCCC1,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Heart, beviljar Lung- och Blood Institute R01088554, T32HL007284 och American Heart Association pre gemenskap 14PRE20420024. Vi tackar särskilt St. Jude Cellular Imaging delade forskning kärnan, inklusive Randall Wakefield och Linda Horner för elektronmikroskopi bilder, Adam Straub för hjälp med representativa immunofluorescens bilder och Pooneh Bagher för henne värdefulla synpunkter på protokollet manuskript.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix?. Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
