Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien
Summary
Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien wird beschrieben, so dass für die Zerlegung der Signalwege im Endothel, glatte Muskulatur, oder zwischen Endothel und glatte Muskulatur (der Myoendothelial-Kreuzung). Die selektive Anwendung des Agonisten oder Protein isoliert, Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenz kann mit diesem Handy-Kultur-Modell genutzt werden.
Abstract
Die Myoendothelial Kreuzung (MEJ), eine eindeutige Signalisierung Microdomain in kleinem Durchmesser Widerstand Arterien, Exponate Lokalisierung von spezifischen Proteinen und Signalisierung Prozesse, die Gefäßtonus und Blutdruck steuern können. Es ist eine Projektion von entweder der Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zelle, und aufgrund seiner geringen Größe (durchschnittlich eine Fläche von ~ 1 µm2), die MEJ ist schwierig, isoliert zu studieren. Jedoch entwickelten wir ein Zelle-Kultur-Modell namens die vaskulären Co Zellkultur (VCCC), die für in-vitro- MEJ Bildung, Endothelzellen Polarisation und Dissektion der Signalisierung Proteine und Prozesse in der Gefäßwand der Widerstand ermöglicht Arterien. Die VCCC hat eine Vielzahl von Anwendungen und kann verschiedene Zelltypen angepasst werden. Das Modell besteht aus zwei Zelltypen gewachsen auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters mit 0,4 µm-Poren, in denen die in-vitro- MEJs bilden können. Hier beschreiben wir, wie erstelle ich die VCCC über Beschichtung von Zellen und Isolierung von Endothelzellen, MEJ, und glatte Muskulatur Brüche, die dann für Protein isoliert oder Aktivität verwendet werden können Assays. Der Filter mit intakten Zellschichten kann eingebettete und geschnittenen immunofluorescent Analyse fixiert werden. Wichtiger ist, wurden viele der Entdeckungen von diesem Modell bestätigt, mit intakten Widerstand Arterien, unterstreicht seine physiologische Bedeutung.
Introduction
In kleinem Durchmesser Widerstand Arterien trennt eine dünne internen elastischen Lamina (IEL) Endothelzellen (EG) und glatten Muskelzellen (SMC). Die Zellen können durch Löcher in dieser elastischen Matrix Projekt und zytoplasmatischen Direktverbindungen über Gap Junction Kanäle1,2. Diese einzigartige Struktur ist die Myoendothelial-Kreuzung (MEJ) bezeichnet. Die MEJ ist eine kleine (ca. 0,5 µm x 0,5 µm, je nach dem vaskulären Bett), zelluläre Projektion besteht überwiegend aus Endothelzellen aber möglicherweise stammen aus glatten Muskulatur sowie3,4. Eine Reihe von Forschern haben gezeigt, die immense Komplexität von Netzwerken, die selektiv auf die MEJ, wodurch es einen besonders wichtigen Standort zur Erleichterung der Bi-direktionale Signalisierung zwischen Endothel und glatten Muskulatur5 auftreten-Signalisierung ,6,7,8,9,10.
Eine mechanistische Dissektion der Signalwege in der MEJ ist jedoch schwierig in einer intakten Arterie. Da die MEJ eine zelluläre Projektion ist, ist es nicht aktuell möglich, eine in Vivo MEJ aus der Gefäßwand zu isolieren. Aus diesem Grund wurde die VCCC Modell1 entwickelt. Wichtig ist, die VCCC repliziert, physiologische endotheliale Morphologie11 und Polarisierung der Signalisierung zwischen der apikalen und MEJ Teile der Zelle12. Es war dieses einzigartige Modell, das die Entdeckung erleichtert, die alpha Hämoglobin in den Endothelzellen polarisiert, die MEJ ist. Dies steht im Gegensatz zu konventionell kultivierten Endothelzellen die alpha Hämoglobin13nicht ausdrücken. Für Forscher mikrovaskulären Endothel interessiert ist es möglicherweise sinnvoller, Endothelzellen, die in der VCCC kultiviert worden verwenden, besonders wenn Sie beabsichtigen, Signalwege zu zergliedern, die in kleinem Durchmesser Widerstand Arterien auftreten.
Kokultur zwei verschiedene Zelltypen eine robuste Kunststoff-Einlage, enthält einen Filter mit kleinem Durchmesser Poren (0,4 µm im Durchmesser) mit wird verhindert, dass die Zellen die Migration zwischen den Schichten. Es ergibt sich ein 10 µm-Abstand zwischen den Zellen, die deutlich länger als in Vivo, aber immer noch viele der in Vivo -Eigenschaften der MEJs, einschließlich Protein Lokalisierung und second Messenger Signalisierung1 repliziert , 14. Darüber hinaus ermöglicht die VCCC für die Ausrichtung der Zelle typspezifische Signalisierung über die Zugabe von ein Agonist oder Antagonist zu den spezifischen zellulären Fach. Z. B. laden die EG mit BAPTA-AM, Kalzium Chelat und Stimulierung der SMC mit Phenylephrin14. Im Gegensatz zu anderen Beschreibungen von Kokulturen Modelle15,16,17,18,19,20,21stellt dies Hinweise auf die unterschiedlichen Fraktionen mRNA und Protein, einschließlich den ausgeprägten MEJ Bruch innerhalb der Poren des Filters zu isolieren. Diese Technik, um die VCCC können für spezifische Untersuchung von Veränderungen der mRNA Lokalisierung oder Transkription22, Protein Phosphorylierung12,23und Protein Aktivität12. Dieser Artikel beschreibt Beschichtung der EG auf dem Filter und SMC auf dem Boden, obwohl es möglich ist, die zwei Zelltypen in verschiedenen Konformationen11,18,24Kultur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die VCCC hat eine Reihe von Vorteilen in Bezug auf die Rekapitulation MEJs in Vitro, aber es gibt Punkte der Diskussion beim festlegen, ob die VCCC für spezifische Anwendung genutzt werden kann. Beispielsweise, wenn verschiedene Zelltypen sind bei diesem Modell verwendet werden, es müssen optimiert werden. Wir haben primären humanen Zellen verwendet, aber es ist möglich, Zellen aus bovine Hauptschlagadern24oder Wildtyp oder Knockout-Mäusen zu isolieren, und verwenden sie in der VCCC<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit von National Heart unterstützt wurde, Lung and Blood Institute gewährt R01088554, der T32HL007284 und der American Heart Association predoctoral Gemeinschaft 14PRE20420024. Wir danken vor allem die St. Jude Cellular Imaging geteilt Forschung Core, einschließlich Randall Wakefield und Linda Horner für die Elektronenmikroskopie Bilder, Adam Straub für die Unterstützung bei repräsentativen Immunfluoreszenz Bilder und Pooneh Bagher für Sie wertvolles Feedback über das Manuskript-Protokoll.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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