En morfometrisk og cellulære analysemetode for den Murine Mandibular kondyl
Summary
Dette manuskript præsenterer metoder til at analysere morfometrisk og cellulære ændringer inden for den mandibular kondyl på gnavere.
Abstract
Kæbeleddet (TMJ) har kapacitet til at tilpasse sig ydre stimuli, og indlæsning af ændringer kan påvirke placeringen af condyles, samt de strukturelle og cellulære komponenter af den mandibular kondylære brusk (MCC). Dette manuskript beskriver metoder til at analysere disse ændringer og en metode til at ændre lastning af TMJ i mus (dvs., trykstyrke statisk TMJ indlæsning). Den strukturelle evaluering illustreret her er en simpel morfometrisk tilgang, der bruger Digimizer software og er udført i røntgenbilleder af små knogler. Derudover analyse af cellulære ændringer fører til ændringer i kollagen udtryk, knoglen remodeling, celledeling, og proteoglycan distribution i MCC er beskrevet. Kvantificering af disse ændringer i histologiske sektioner – ved at tælle de positive fluorescerende pixel ved hjælp af software og måle afstanden kortlægning billedet og farves område med Digimizer – er også vist. De metoder, der er vist her er ikke begrænset til murine TMJ, men kunne være brugt på ekstra knogler af små eksperimentelle dyr og i andre regioner af endochondral ossifikation.
Introduction
I TMJ er en unik bærende fælles beliggende i regionen kraniofacial og er dannet af fibrocartilage. MCC i TMJ er afgørende for ledfunktion, herunder uhindret kæbe bevægelse mens taler og masticating, men det er almindeligt påvirket af degenerative sygdomme, herunder slidgigt1. I TMJ har kapacitet til at tilpasse sig ydre stimuli og lastning ændringer, fører til strukturel og cellulære ændringer til komponenterne i MCC2,3,4,5. De bærende egenskaber af MCC kan forklares af vekselvirkninger mellem dets bestanddele, herunder vand, kollagen-netværk og tæt pakket proteoglycaner. The MCC har fire forskellige cellulære zoner, der udtrykker forskellige typer af kollagen og ikke-kollagen proteiner: 1) den overfladiske eller artikulære zone; 2) den proliferativ zone, der består af udifferentierede mesenchymale celler og der reagerer på lastning krav; 3) den prehypertrophic zone, der består af modne chondrocytter udtryk for kollagen type 2; og 4) den hypertrofisk zone, den region, hvor de hypertrofisk chondrocytter udtryk for kollagen type 10 dør og gennemgå forkalkning. Ikke-mineraliseret regionen er rig på proteoglycaner, som giver resistens over for trykstyrke styrker6.
Der er løbende mineralisering på Hypertrofiske zone af MCC, hvor overgangen fra chondrogenesis til osteogenesis opstår, garantere subchondral knogle af mandibular kondyl7robust mineral struktur. Cellulære ændringer i regionerne unmineralized og mineraliseret i sidste ende føre til morfologiske og strukturelle ændringer i mandibular kondyl og underkæben. Opretholdelsen af homøostase i alle cellulære regioner af MCC og mineralisering af subchondral del er afgørende for sundhed, bæreevne og integritet af TMJ.
Flere kollagen transgene musemodel (som beskrevet af Utreja et al.) 8 er et fantastisk værktøj til at bruge til at forstå ændringer i kollagen udtryk, fordi alle transgener udtrykkes i MCC. For en dybdegående histologisk vurdering, er histologiske pletter brugt til at studere matrix deposition, mineralisering, celleproliferation, og apoptose samt protein udtryk på de forskellige cellelag af MCC.
I dette bruges manuskript, histologiske og morfometrisk analyser til at evaluere cellulære og strukturelle ændringer i MCC og subchondral knoglen af den mandibular kondyl på mus. Derudover er en celle kvantificering metode, til at analysere fluorescerende histologiske billeder og for kortlægning af lys objektglas, beskrevet. Trykstyrke statisk TMJ lastning metode, som forårsager cellulære og morfologiske ændringer på MCC og subchondral knogle9, er også illustreret for at validere vores metoder.
De metoder, der beskrives her kan bruges til at bestemme morfometrisk og histologiske forandringer i mandibular kondyl og underkæben af gnavere eller at analysere andre regioner af endochondral ossifikation og morfologi af yderligere mineraliseret væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskript beskrevet metoder for morfometrisk måling og cellulære analyse af murine mandibular condyles og hvaltænder. Radiografisk morfometrisk målingerne kan også bruges til at analysere andre knogler fra små forsøgsdyr. Derudover den cellulære analyse (celle kvantificering og brusk afstand kortlægning) er ikke begrænset til de gnaver mandibular kondyl, men kan bruges til at kvantificere histologiske sektioner af talrige væv.
Transgene musemodeller udtrykker fluorescerende j…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. David Rowe bedes give Transgene mus og Li Chen histologiske bistand.
Den forskning, der er rapporteret i denne publikation blev støttet af det nationale Institut for Dental & kraniofaciale forskning af National Institutes of Health under Award nummer K08DE025914 og af den amerikanske sammenslutning af Ortodontisk Foundation at Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
References
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
