Un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica
Summary
Questo manoscritto presenta metodi per l’analisi morfometrica e cambiamenti cellulari all’interno del condilo mandibolare di roditori.
Abstract
Il giunto temporomandibular (TMJ) ha la capacità di adattarsi agli stimoli esterni, e cambiamenti di carico possa influenzare la posizione dei condili, così come i componenti strutturali e cellulari della cartilagine del condilo mandibola (MCC). Questo manoscritto descrive metodi per l’analisi di questi cambiamenti e un metodo per alterare il caricamento dell’ATM in topi (cioè, alla compressione statica TMJ caricamento). La valutazione strutturale qui illustrata è un approccio semplice morfometriche che utilizza il software Digimizer e viene eseguito nelle radiografie di piccole ossa. Inoltre, l’analisi del cellulare cambia leader alle alterazioni nell’espressione del collagene, rimodellamento osseo, divisione cellulare, e distribuzione di proteoglycan in MCC è descritto. La quantificazione di questi cambiamenti nelle sezioni istologiche – contando i pixel fluorescenti positivi utilizzando software e il mapping di distanza di misurazione di immagine e zona macchiata con Digimizer – è dimostrato anche. I metodi qui illustrati non sono limitati a TMJ murino, ma ha potuto essere usati su altre ossa di piccoli animali da esperimento e in altre regioni di ossificazione endochondral.
Introduction
TMJ è un unico giunto portante che si trova nella regione craniofacial ed è costituito di fibrocartilagine. Il MCC del TMJ è essenziale per la funzione articolare, compreso movimento della mascella senza ostacoli mentre parlando e masticare, ma esso è influenzato dalle malattie degeneranti, compreso l’osteoartrite1. L’ATM ha la capacità di adattarsi a stimoli esterni e le alterazioni di carico, portando a cambiamenti strutturali e cellulari ai componenti del MCC2,3,4,5. Le proprietà portanti di MCC possono essere spiegate dalle interazioni tra i suoi costituenti, compresa l’acqua, la rete di collagene e densamente proteoglicani. Il MCC ha quattro distinte zone cellulari che esprimono diversi tipi di proteine di collagene e non-collagene: 1) l’area superficiale o articolare; 2) la zona proliferativa, composta di cellule mesenchimali indifferenziate e che risponde al carico di richieste; 3) la zona di prehypertrophic, composto da condrociti maturi esprimendo il collagene di tipo 2; e 4) l’ipertrofica di zona, la regione dove i condrociti ipertrofici esprimendo collagene tipo 10 die e sottoposti a calcificazione. La regione non mineralizzato è ricca di proteoglicani che offrono resistenza alle forze di compressione6.
C’è la mineralizzazione continua alla zona ipertrofica del MCC, dove si verifica la transizione da Condrogenesi ad osteogenesi, garantendo la robusta struttura minerale dell’osso subcondrale del condilo mandibolare7. Cambiamenti cellulari nelle regioni unmineralized e mineralizzate in ultima analisi, portano a cambiamenti morfologici e strutturali nel condilo mandibolare e mandibola. Mantenimento dell’omeostasi cellulare tutte le regioni di MCC e la mineralizzazione della porzione subchondral sono essenziali per la salute, capacità di carico e l’integrità dell’ATM.
Il modello di topo transgenico collagene multipli (come descritto da Utreja et al.) 8 è un ottimo strumento da utilizzare per comprendere i cambiamenti nell’espressione di collagene poiché tutti i transgeni sono espressi in MCC. Per un’approfondita valutazione istologica, macchie istologiche sono utilizzate per studiare la deposizione di matrice, mineralizzazione, proliferazione delle cellule e apoptosi, come pure l’espressione della proteina presso gli strati differenti delle cellule del MCC.
In questo manoscritto, istologico e le analisi morfometriche vengono utilizzate per valutare i cambiamenti strutturali e cellulari nell’osso MCC e subcondrale del condilo mandibola di topi. Inoltre, un metodo di quantificazione delle cellule, per analizzare le immagini istologiche fluorescente e per il mapping di vetrini da microscopio chiaro, è descritto. Compressione statica TMJ caricamento metodo che causa cambiamenti cellulari e morfologiche al MCC e subchondral dell’osso9, è illustrata anche per convalidare i nostri metodi.
I metodi descritti qui possono essere utilizzati per determinare morfometriche e cambiamenti istologici nel condilo mandibolare e mandibola di roditori o di analizzare altre regioni di ossificazione endochondral e la morfologia dei tessuti mineralizzati aggiuntive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descritto metodi per la misurazione di morfometrica e analisi cellulare del murini condili mandibolari e mandibole. Le misure morfometriche radiografica è utilizzabile anche per analizzare altre ossa da piccoli animali da esperimento. Inoltre, l’analisi cellulare (cellule quantificazione e mappatura di distanza di cartilagine) non sono limitati al condilo mandibola roditore, ma può essere utilizzato per quantificare le sezioni istologiche di numerosi tessuti.
Modelli di to…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il Dr. David Rowe per gentilmente fornire i topi transgenici e Li Chen per l’assistenza istologico.
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental & Craniofacial Research del National Institutes of Health, sotto Premio numero K08DE025914 e dalla associazione americana di Fondazione ortodontico per Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
References
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