Avanserte AC Confocal mikroskopi teknikker for å studere Protein-protein interaksjoner og Kinetics på DNA lesjoner
Summary
Laser microirradiation er et nyttig verktøy for studier av DNA-reparasjon i levende celler. En metodisk tilnærming for bruk av UVA lasere å indusere ulike DNA lesjoner vises. Vi har optimalisert en metode for lokale microirradiation som opprettholder normal celle syklus; Dermed fortsetter bestrålt celler gjennom mitose.
Abstract
Lokale microirradiation med lasere representerer et nyttig verktøy for studier av DNA-reparasjon-relaterte prosesser i levende celler. Her beskriver vi en metodisk tilnærming til å analysere protein kinetics på DNA lesjoner over tid eller protein-protein interaksjoner på lokalt microirradiated chromatin. Vi viser også hvordan du gjenkjenner enkelte fasene av cellen syklus bruker Fucci mobilnettet system for å studere celle-syklus-avhengige proteiner kinetics på DNA lesjoner. En metodisk beskrivelse av bruk av to UV lasere (355 nm og 405 nm) å indusere typer DNA skade er også presentert. Bare celler microirradiated av 405-nm diode laser gått gjennom mitose normalt og var uten cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). Vi viser også hvordan microirradiated celler kan festes på et gitt tidspunkt å utføre immunodetection av endogene proteiner av interesse. For DNA reparasjon studiene, vi i tillegg beskriver bruk av Biofysiske metoder inkludert FRAP (fluorescens gjenoppretting etter Photobleaching) og FLIM (fluorescens levetid Imaging mikroskopi) i celler med spontant forekommende DNA skade foci. Vi viser også en anvendelse av FLIM-bånd (fluorescens resonans energi Transfer) i eksperimentelle studier av protein-protein interaksjoner.
Introduction
DNA skade fører til utseendet på DNA lesjoner som består av cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine, og single-strand eller dobbel-strand bryter1,2. Den ble-stråler er form av ioniserende stråling med høyeste energi og høy penetrance, dermed kilden av stråling er mye brukt i strålebehandling3. På den annen side, indusert eksperimentelt DNA skade forårsaket av UV lasere etterlikner naturlige eksponering for UV-lys. UVA microirradiation, representerer som mikroskopiske, en eksperimentell verktøy for å studere DNA skade i individuelle levende celler. Microirradiation ble brukt for første gang 40 år siden for å vise organiseringen av kromosom regioner4,5. Denne teknikken er svært avhengig av enten funksjonelle egenskaper AC confocal mikroskop eller de tekniske begrensningene i moderne nanoscopy. For å indusere DNA lesjoner, kan celler være presensitized av 5′ bromodeoxyuridine (BrdU) eller Hoechst 33342 før UV bestråling. Bártová et al. 6 tidligere beskrevet presensitization trinn, og nylig vi optimalisert denne microirradiation teknikken for å unngå celledød, eller apoptose. For eksempel fører bruk av en 405-nm UV laser (uten Hoechst 33342 presensitization) til induksjon av 53BP1-positive dobbel-strand bryter (DSBs) på bekostning av cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). På den annen side, presensitization trinn kombinert med UV microirradiation induserer svært høye nivåer av CPDs og DSBs samtidig7,8. Denne metodikken er vanskelig å bruke til studiet av en enkelt DNA repair pathway.
Med microirradiation er det mulig å analysere protein rekruttering, kinetics og interaksjon på DNA lesjoner i levende celler. Et eksempel på denne metoden ble utgitt av Luijsterburg et al. 9 for heterochromatin protein 1β, og vi nylig viste for første gang pluripotency faktoren Oct4 og et protein forbundet med Cajal organer, Marianne, rekrutteres UV-indusert DNA lesjoner6,10. Protein kinetics på disse DNA lesjoner kan også bli studert bruker FRAP (fluorescens gjenoppretting etter Photobleaching)11,12,13 eller bånd (fluorescens resonans energi Transfer) teknikker14 ,15. Disse metodene har potensial til å avsløre enkel spredning av proteiner DNA lesjonene eller protein-protein interaksjoner. Et nyttig verktøy for flere karakteristikk av proteiner er FLIM (fluorescens levetid Imaging mikroskopi) eller kombinasjonen med bånd teknologi (bånd-FLIM)16. Disse metodene at studiet av prosesser i cellene som er stabilt å uttrykke transiently protein rundt merket med et fluorescerende molekyl17. Her vises et eksempel på eksponensiell decay tid (τ) for GFP-merket p53 protein og samhandling partner, mCherry-merket 53BP1, spiller en viktig rolle i DNA skade svar18,19 . Parameteren-τ er levetiden til fluorochrome fra FLIM beregninger, spesifikk for en gitt fluorescens fargestoff, sine bindende evner og omgivelsene mobilnettet. Denne metoden kan derfor vise oss forskjeller mellom protein subpopulasjoner, deres bindende evner og deres funksjonelle egenskaper etter, for eksempel DNA skade.
Her, en oversikt over de metodologiske tilnærmingsmåter av avanserte mikroskopi teknikker som brukes i vårt laboratorium for å studere tid-spesifikke protein rekruttering, kinetikk, diffusjon og protein-protein interaksjoner på stedet av microirradiated chromatin presenteres. Trinnvise metodene for induksjon av lokale DNA lesjoner i levende celler, og en beskrivelse av metoder som er nyttig for studier av DNA-skade-relaterte hendelser på lokalt indusert DNA lesjoner forårsaket av UV lasere er gitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi teknikker representerer grunnleggende verktøy i forskningslaboratorier. Her en kort beskrivelse av metodene brukes for studiet av protein rekruttering og kinetics på DNA lesjoner vises. Vi bemerket spesielt vår eksperimentelle erfaring i feltet av lokale microirradiation av levende celler, og vi diskutere studiet av protein kinetics av FRAP og protein-protein interaksjon på DNA lesjoner av acceptor-bleking bånd28 og de avanserte modifisering bånd-FLIM (figur 4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Grant byrået i Tsjekkia, prosjektet P302-12-G157. Eksperimentene ble også støttet av tsjekkiske-norsk forskning program CZ09, som er under tilsyn av norske fond, og av departementet for utdanning, ungdom og Sport i Tsjekkia (gi nummer: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
