Передовые методы Confocal микроскопии для изучения кинетики в повреждения ДНК и белок белковых взаимодействий
Summary
Лазерная microirradiation является полезным инструментом для исследования ДНК ремонта в живых клетках. Методологический подход к использования УФ лазеров чтобы побудить различные поражения ДНК показано. Мы оптимизировали метод для местных microirradiation, который поддерживает нормальное клеточного цикла; Таким образом облученных клеток перейти через митоз.
Abstract
Местные microirradiation с лазерами представляет собой полезный инструмент для исследования процессов, связанных с ДНК ремонт, в живых клетках. Здесь мы описываем методологический подход к анализу белка кинетики в ДНК повреждения по времени или белок белковых взаимодействий на локально microirradiated хроматина. Мы также показывают, как распознавать отдельные фазы клеточного цикла с использованием сотовой системы Fucci для изучения кинетики клеток цикл зависимых белков в повреждения ДНК. Методологические описания использования двух УФ лазеров (355 Нм и 405 нм) чтобы побудить различные типы повреждений ДНК также представил. Только клетки microirradiated лазерного диода 405 нм обычно перешла через митоз и были лишены Циклобутан пиримидина димеров (ДСП). Мы также показывают, как microirradiated клетки может устанавливаться на данный момент для выполнения immunodetection эндогенных протеинов интереса. Для ремонта исследования ДНК, мы дополнительно описывают использование биофизических методов, включая FRAP (флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание) и FLIM (Imaging микроскопии флуоресцирования жизни) в клетках с спонтанно возникающих очагов повреждения ДНК. Мы также показывают применение FLIM-Лада (флуоресценции резонанс передачи энергии) в экспериментальных исследованиях белок белковых взаимодействий.
Introduction
Повреждение ДНК приводит к появлению поражения ДНК, состоящий из Циклобутан пиримидина димеров (ДСП), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine и одно нить или двухнитевые разрывы1,2. Гамма-лучи являются формой ионизирующего излучения с высокой энергией и высокой пенетрантностью, таким образом этот источник излучения широко используется в радиотерапии3. С другой стороны экспериментально индуцированного повреждения ДНК, вызванные УФ лазеров имитирует естественный воздействие ультрафиолетовым светом. UVA microirradiation, как микроскопические метод, представляет собой экспериментальный инструмент для изучения повреждения ДНК в отдельных живых клеток. Microirradiation был использован в первый раз 40 лет тому назад для того, чтобы выявить организации хромосома регионов4,5. Эта техника очень сильно зависит от функциональных свойств конфокальные микроскопы или технические пределы современного наноскопия. Чтобы вызвать повреждения ДНК, клетки могут presensitized 5′ Бромдезоксиуридин (BrdU) или Hoechst 33342 до УФ облучения. Bártová и др. 6 описано presensitization шаг, и недавно мы оптимизировали этот метод microirradiation для того, чтобы избежать смерти клетки или apoptosis. Например использование 405 нм УФ лазер (без presensitization Hoechst 33342) приводит к индукции 53BP1-позитивных двухнитевые разрывы (DSBs) за счет Циклобутан пиримидина димеров (ДСП). С другой стороны, presensitization шаги в сочетании с УФ microirradiation вызвать очень высокий уровень ДСП и DSBs одновременно7,8. Эта методология трудно применять к изучению один путь восстановления ДНК.
С microirradiation можно анализировать набор белков, кинетики и взаимодействие на повреждения ДНК в живых клетках. Пример этого метода была опубликована Luijsterburg соавт. 9 для гетерохроматин белка 1β и мы недавно показали в первый раз, что плюрипотентности факторов Oct4 и белок, который связывается с тела Cajal, проекта, набираются для УФ индуцированной ДНК поражений6,10. Кинетика белка на этих повреждений ДНК также могут быть изучены с помощью FRAP (флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание)11,12,13 или ладу (флуоресценции резонанс передачи энергии) методы14 ,15. Эти методы имеют потенциал, чтобы выявить простой диффузии белков в повреждения ДНК или белок белковых взаимодействий. Полезным инструментом для дополнительных характеристик белков является FLIM (Imaging микроскопии флуоресцирования жизни) или его комбинации с ЛАДАМИ технологии (Лада-FLIM)16. Эти методы позволяют исследование процессов в живых клеток, которые являются стабильно или временно выражения протеина интереса, помеченный флуоресцентных молекул17. Здесь приведен пример времени (τ) экспоненциальный распад белка GFP-тегами p53 и взаимодействия партнера, 53BP1, mCherry меткой, играет важную роль в ДНК повреждения ответ18,19 . Параметр τ, время жизни флюрохром, предоставляемый FLIM расчеты, специфичных для данного флуоресценции красителя, его способности привязки и ее клеточной среды. Таким образом этот метод может показать нам различия между белка субпопуляций, их способности привязки и их функциональные свойства после, например, повреждение ДНК.
Здесь, наброски методологических подходов микроскопии передовых методов, которая используется в нашей лаборатории для изучения набора время специфических белков, кинетика, диффузии и белок белковых взаимодействий на сайте microirradiated хроматина представлены. Предоставляются пошаговые методологии для индукции местного поражения ДНК в живых клетках и описание методологии полезно для изучения событий, связанных с ДНК ущерб, на локально индуцированных поражения ДНК, вызванные УФ лазеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроскопия методы представляют собой основные инструменты в исследовательских лабораториях. Здесь краткое описание методов, используемых для изучения белков вербовки и представил кинетики в повреждения ДНК. Мы особенно отметили наш экспериментальный опыт в области местных microirradiati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана агентства по субсидированию Чешской Республики, проект P302-12-G157. Эксперименты были также поддержаны Чешский-Норвежский исследовательской программы CZ09, которая находится под контролем норвежских фондов и Министерство образования, молодежи и спорта Чешской Республики (номер гранта: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
