Avancerad konfokalmikroskopi tekniker för att studera Protein-protein interaktioner och kinetik på DNA lesioner
Summary
Laser microirradiation är ett användbart verktyg för studier av DNA-reparation i levande celler. En metod för användning av UVA lasrar att framkalla olika DNA lesioner visas. Vi har optimerat en metod för lokal microirradiation som upprätthåller normala cellcykelns; Således, bestrålade celler vidare genom Mitos.
Abstract
Lokala microirradiation med laser representerar ett användbart verktyg för studier av DNA-reparation-relaterade processer i levande celler. Här, beskriver vi en metod att analysera protein kinetik på DNA skador över tid eller protein-protein interaktioner på lokalt microirradiated kromatin. Vi visar också hur man känner igen olika faser av cellcykeln använder Fucci cellulära systemet för att studera cell-cykel-beroende protein kinetik på DNA lesioner. Metodbeskrivningen för användning av två UV-lasrar (355 nm och 405 nm) att framkalla olika typer av DNA-skador presenteras också. Endast de celler microirradiated av 405-nm diode laser fortsatte genom Mitos normalt och var saknar cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). Vi visar också hur microirradiated celler kan fastställas vid en given tidpunkt att utföra immunodetection av endogena proteiner av intresse. DNA reparation i studierna, beskriver vi dessutom biofysikaliska metoder inklusive FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning) och FLIM (livstid Imaging fluorescensmikroskopi) i celler med spontant förekommer DNA skador foci. Vi visar också en tillämpning av FLIM-bandet (fluorescens resonans energi Transfer) i experimentella studier av protein-protein interaktioner.
Introduction
DNA-skador leder till uppkomsten av DNA lesioner bestående av cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine och singel-strand eller dubbel-strand breaks1,2. Γ-strålning är i form av joniserande strålning med högsta energi och hög penetrans, således denna källa av strålning används allmänt i strålbehandling3. Däremot, inducerad experimentellt DNA-skador som orsakas av UV lasrar härmar naturlig exponering för UV-ljus. UVA microirradiation, representerar som en mikroskopisk metod, en experimentella verktyg för att studera DNA-skador i enskilda levande celler. Microirradiation användes för första gången 40 år sedan för att avslöja organisationen av kromosom regioner4,5. Denna teknik är mycket beroende av antingen funktionella egenskaper confocal Mikroskop eller tekniska gränserna för modern nanoskopi. För att inducera DNA lesioner, kan celler vara presensitized av 5′ Bromdeoxiuridin (BrdU) eller Hoechst 33342 före UV-bestrålning. Bártová et al. 6 tidigare beskrivits det presensitization steget, och nyligen vi optimerat denna microirradiation teknik för att undvika celldöd eller apoptos. Till exempel leder användning av en 405-nm UV-laser (utan Hoechst 33342 presensitization) till induktion av 53BP1-positiv dubbel-strand raster (DSBs) på bekostnad av cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). Å andra presensitization steg i kombination med UV microirradiation framkalla mycket höga nivåer av CPDs och DSBs samtidigt7,8. Denna metod är svårt att tillämpa på studiet av en enda väg för DNA-reparation.
Med microirradiation är det möjligt att analysera protein rekrytering, kinetik och interaktion på DNA skador i levande celler. Ett exempel på denna metod publicerades av Luijsterburg et al. 9 för Heterokromatin protein 1β och vi visade nyligen för första gången som den pluripotency faktorn Oct4 och ett protein som är associerad med Cajal förkroppsligar, coilin, rekryteras till UV-inducerad DNA lesioner6,10. Protein kinetik vid dessa DNA-skador kan också studeras med hjälp av FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning)11,12,13 eller GRÄMA (fluorescens resonans energi Transfer) tekniker14 ,15. Dessa metoder har potential att avslöja enkel diffusion av proteiner vid DNA lesioner eller protein-protein interaktioner. Ett användbart verktyg för ytterligare karakterisering av proteiner är FLIM (livstid Imaging fluorescensmikroskopi) eller dess kombination med bandet teknik (bandet-FLIM)16. Dessa metoder gör det möjligt att studera processer i levande celler som är stabilt eller övergående uttrycker proteinet av intresse märkta av en fluorescerande molekyl17. Här visas ett exempel på exponentiell förfalla time (τ) för GFP-märkta p53 protein och dess interaktion partner, mCherry-taggade 53BP1, spelar en viktig roll i DNA skador svar18,19 . Den parametern τ, är livstid den fluorokrom som tillhandahålls av FLIM beräkningar, specifika för en viss fluorescens färg, dess bindande förmågor och dess cellulära miljön. Därför, denna metod kan visa oss distinktioner mellan protein subpopulations, deras bindande förmågor och deras funktionella egenskaper efter, exempelvis DNA-skador.
Här, en disposition av metodologiska tillvägagångssätt av avancerad mikroskopi tekniker som används i vårt laboratorium för att studera tid-specifika protein rekrytering, kinetik, diffusion och protein-protein interaktioner på platsen av microirradiated kromatin presenteras. Den stegvisa metoden för induktion av lokala DNA lesioner i levande celler, och en beskrivning av metoder som är användbara för studier av DNA-skada-relaterade händelser på lokalt inducerad DNA skador orsakade av UV-lasrar finns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi tekniker utgör grundläggande verktyg i forskningslaboratorier. Här en kort beskrivning av metoderna som används för studier av protein rekrytering och kinetik på DNA lesioner presenteras. Noterade vi särskilt våra experimentella erfarenheter inom lokala microirradiation av levande celler, och vi diskutera studiet av protein kinetik av FRAP och protein-protein interaktioner på DNA skador av acceptor-blekning bandet28 och dess avancerade ändring bandet-FLIM (<strong class="xfig"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Grant byrån i Tjeckien, projektet P302-12-G157. Experiment stöddes också av den tjeckiska-norska forskning programmet CZ09, som övervakas av norska medel och av ministeriet för utbildning, ungdom och idrott i Tjeckien (bevilja nummer: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
