Laser microirradiation er et nyttig verktøy for studier av DNA-reparasjon i levende celler. En metodisk tilnærming for bruk av UVA lasere å indusere ulike DNA lesjoner vises. Vi har optimalisert en metode for lokale microirradiation som opprettholder normal celle syklus; Dermed fortsetter bestrålt celler gjennom mitose.
Lokale microirradiation med lasere representerer et nyttig verktøy for studier av DNA-reparasjon-relaterte prosesser i levende celler. Her beskriver vi en metodisk tilnærming til å analysere protein kinetics på DNA lesjoner over tid eller protein-protein interaksjoner på lokalt microirradiated chromatin. Vi viser også hvordan du gjenkjenner enkelte fasene av cellen syklus bruker Fucci mobilnettet system for å studere celle-syklus-avhengige proteiner kinetics på DNA lesjoner. En metodisk beskrivelse av bruk av to UV lasere (355 nm og 405 nm) å indusere typer DNA skade er også presentert. Bare celler microirradiated av 405-nm diode laser gått gjennom mitose normalt og var uten cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). Vi viser også hvordan microirradiated celler kan festes på et gitt tidspunkt å utføre immunodetection av endogene proteiner av interesse. For DNA reparasjon studiene, vi i tillegg beskriver bruk av Biofysiske metoder inkludert FRAP (fluorescens gjenoppretting etter Photobleaching) og FLIM (fluorescens levetid Imaging mikroskopi) i celler med spontant forekommende DNA skade foci. Vi viser også en anvendelse av FLIM-bånd (fluorescens resonans energi Transfer) i eksperimentelle studier av protein-protein interaksjoner.
DNA skade fører til utseendet på DNA lesjoner som består av cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine, og single-strand eller dobbel-strand bryter1,2. Den ble-stråler er form av ioniserende stråling med høyeste energi og høy penetrance, dermed kilden av stråling er mye brukt i strålebehandling3. På den annen side, indusert eksperimentelt DNA skade forårsaket av UV lasere etterlikner naturlige eksponering for UV-lys. UVA microirradiation, representerer som mikroskopiske, en eksperimentell verktøy for å studere DNA skade i individuelle levende celler. Microirradiation ble brukt for første gang 40 år siden for å vise organiseringen av kromosom regioner4,5. Denne teknikken er svært avhengig av enten funksjonelle egenskaper AC confocal mikroskop eller de tekniske begrensningene i moderne nanoscopy. For å indusere DNA lesjoner, kan celler være presensitized av 5′ bromodeoxyuridine (BrdU) eller Hoechst 33342 før UV bestråling. Bártová et al. 6 tidligere beskrevet presensitization trinn, og nylig vi optimalisert denne microirradiation teknikken for å unngå celledød, eller apoptose. For eksempel fører bruk av en 405-nm UV laser (uten Hoechst 33342 presensitization) til induksjon av 53BP1-positive dobbel-strand bryter (DSBs) på bekostning av cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). På den annen side, presensitization trinn kombinert med UV microirradiation induserer svært høye nivåer av CPDs og DSBs samtidig7,8. Denne metodikken er vanskelig å bruke til studiet av en enkelt DNA repair pathway.
Med microirradiation er det mulig å analysere protein rekruttering, kinetics og interaksjon på DNA lesjoner i levende celler. Et eksempel på denne metoden ble utgitt av Luijsterburg et al. 9 for heterochromatin protein 1β, og vi nylig viste for første gang pluripotency faktoren Oct4 og et protein forbundet med Cajal organer, Marianne, rekrutteres UV-indusert DNA lesjoner6,10. Protein kinetics på disse DNA lesjoner kan også bli studert bruker FRAP (fluorescens gjenoppretting etter Photobleaching)11,12,13 eller bånd (fluorescens resonans energi Transfer) teknikker14 ,15. Disse metodene har potensial til å avsløre enkel spredning av proteiner DNA lesjonene eller protein-protein interaksjoner. Et nyttig verktøy for flere karakteristikk av proteiner er FLIM (fluorescens levetid Imaging mikroskopi) eller kombinasjonen med bånd teknologi (bånd-FLIM)16. Disse metodene at studiet av prosesser i cellene som er stabilt å uttrykke transiently protein rundt merket med et fluorescerende molekyl17. Her vises et eksempel på eksponensiell decay tid (τ) for GFP-merket p53 protein og samhandling partner, mCherry-merket 53BP1, spiller en viktig rolle i DNA skade svar18,19 . Parameteren-τ er levetiden til fluorochrome fra FLIM beregninger, spesifikk for en gitt fluorescens fargestoff, sine bindende evner og omgivelsene mobilnettet. Denne metoden kan derfor vise oss forskjeller mellom protein subpopulasjoner, deres bindende evner og deres funksjonelle egenskaper etter, for eksempel DNA skade.
Her, en oversikt over de metodologiske tilnærmingsmåter av avanserte mikroskopi teknikker som brukes i vårt laboratorium for å studere tid-spesifikke protein rekruttering, kinetikk, diffusjon og protein-protein interaksjoner på stedet av microirradiated chromatin presenteres. Trinnvise metodene for induksjon av lokale DNA lesjoner i levende celler, og en beskrivelse av metoder som er nyttig for studier av DNA-skade-relaterte hendelser på lokalt indusert DNA lesjoner forårsaket av UV lasere er gitt.
Mikroskopi teknikker representerer grunnleggende verktøy i forskningslaboratorier. Her en kort beskrivelse av metodene brukes for studiet av protein rekruttering og kinetics på DNA lesjoner vises. Vi bemerket spesielt vår eksperimentelle erfaring i feltet av lokale microirradiation av levende celler, og vi diskutere studiet av protein kinetics av FRAP og protein-protein interaksjon på DNA lesjoner av acceptor-bleking bånd28 og de avanserte modifisering bånd-FLIM (figur 4…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Grant byrået i Tsjekkia, prosjektet P302-12-G157. Eksperimentene ble også støttet av tsjekkiske-norsk forskning program CZ09, som er under tilsyn av norske fond, og av departementet for utdanning, ungdom og Sport i Tsjekkia (gi nummer: 7F14369).
Cell cultivation | |||
HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell transfection | |||
GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Confocal microscopy | |||
Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
White-light laser | Leica Microsystems | ||
355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunofluorescence staining | |||
Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |