Modificeret Terminal Restriktion Fragment Analyse til kvantificering af telomer længde ved brug af in-gel hybridisering
Summary
I denne artikel diskuteres en detaljeret protokol til kvantificering af telomerlængden ved hjælp af en modificeret terminalbegrænsningsfragmentanalyse, som giver hurtig og effektiv direkte måling af telomerlængde. Denne teknik kan anvendes på en række cellekilder til DNA til kvantificering af telomerlængden.
Abstract
Der er flere forskellige teknikker til måling af telomerlængden, hver med deres egne fordele og ulemper. Den traditionelle tilgang, Telomere Restriction Fragment (TRF) analyse, anvender en DNA hybridiseringsteknik, hvorved genomiske DNA-prøver fordøjes med restriktionsenzymer, efterlader telomere DNA-gentagelser og noget sub-telomer DNA. Disse adskilles af agarosegelelektroforese, overføres til en filtermembran og hybridiseres til oligonukleotidprober mærket med enten kemiluminescens eller radioaktivitet til visualisering af telomer-restriktionsfragmenter. Denne fremgangsmåde, når der kræves en større mængde DNA end andre teknikker, såsom PCR, kan måle telomer-længdefordelingen af en population af celler og tillader måling udtrykt i absolutte kilobaser. Dette manuskript demonstrerer en modificeret DNA-hybridiseringsprocedure til bestemmelse af telomerlængden. Genomisk DNA fordøjes først med restriktionsenzymer (som ikke skæresTelomerer) og adskilt af agarosegelelektroforese. Gelen tørres derefter, og DNA'et denatureres og hybridiseres in situ til en radioaktivt mærket oligonukleotidprobe. Denne in situ hybridisering undgår tab af telomere DNA og forbedrer signalintensiteten. Efter hybridisering afbildes gelerne under anvendelse af phosphorskærme, og telomerlængden kvantificeres ved anvendelse af et grafprogram. Denne procedure blev udviklet af laboratorierne i Drs. Woodring Wright og Jerry Shay ved University of Texas Southwestern 1 , 2 . Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af denne procedure, med nogle ændringer.
Introduction
Telomerer, der ligger i enderne af kromosomer, er nukleotid gentagelser af sekvensen TTAGGG (på humane kromosomer), der spiller en kritisk rolle i beskyttelsen af cellulær genetisk information 3 , 4 , 5 . Telomerer er adskillige tusinde basepar i længden og tjener til at beskytte integriteten af resten af kromosomet under DNA-replikation. Replikation af kromosomer er ikke perfekt, hvilket resulterer i, at enderne af kromosomet ikke bliver fuldstændigt kopieret. Denne ineffektivitet ved replikation betegnes som "end replikationsproblemet" og resulterer i tab af nogle af telomere-gentagelserne under hver runde af replikation 6 , 7 . Telomerlængden kan gendannes efter celledeling med telomerase, et enzym, der erstatter de tabte telomere sekvenser 8 , 9 . Telomerase er imidlertid ikkeAktiveret i de fleste humane somatiske celler, og som følge heraf vil telomerer med tiden forkortes, hvilket resulterer i en cellulær senescens 10 . På grund af telomereforkortelse betragtes telomerer som en biomarkør af aldring og risiko for aldersrelaterede sygdomme 11 , 12 . Derudover kan telomerlængden påvirkes af genetiske, miljømæssige og livsstilsfaktorer og andre stimuli såsom oxidativ stress, hvilket indikerer at telomerlængden kan spille en rolle som biomarkør i toksikologiske, epidemiologiske og adfærdsmæssige studier 13 , 14 , 15 .
Denne artikel demonstrerer en teknik til måling af telomerlængde ved anvendelse af en modificeret terminal-restriktionsfragment (TRF) analyse tilpasset fra Mender og Shay 2 og Kimura et al. 16 , og ligner Herbert, Shay og WrigHt 1 og haussmann og Mauck 17 Traditionelt involverer TRF-analyse en Southern blot-procedure. Southern blots betragtes som "guldstandarden" til undersøgelse af telomererlængde og anvendes aktivt til undersøgelse af leukocyttelomerlængde i epidemiologiske undersøgelser 18 . Denne TRF-analyse anvender fordøjet genomisk DNA, der efterlader telomere-gentagelserne. Dnafragmenterne separeres derefter ved gelelektroforese, denatureres og overføres til en nitrocellulosemembran. Telomere-sekvenserne hybridiseres til en telomer-oligonukleotidprobe. I stedet for at overføre de adskilte telomerer til en membran, bruger andre TRF-teknikker in-gel hybridiseringsteknikker med og uden denaturering af DNA'et. Inklusion af denaturering er vigtig, når man overvejer detektion af interstitielle telomerer, som er blevet rapporteret hos nogle arter 19 . Procedurer, der mangler denaturerende trin, opdager kun thE enkeltstrengede DNA-overhæng ved terminale telomerer og vil ikke binde til interstitielle telomere sekvenser 18 .
Udover TRF analyse er der flere andre teknikker til måling af telomerlængden, der hver især har deres egne fordele og ulemper. Flow-FISH-teknikken kan måle gennemsnitlig telomerlængde af individuelle celler af en distinkt celletype ved anvendelse af flowcytometri 16 , 20 . Selvom det nøjagtigt kan mærke telomerer med meget specifikke prober og reducere menneskelig fejl gennem automatisering, er Flow-FISH dyrere, mindre effektiv og kræver friske prøver og en højtuddannet tekniker, der begrænser sin evne til epidemiologiske undersøgelser 16 . Derudover tegner denne metode ikke for mulige ændringer i antallet af kromosomer i cellepopulationen. En anden teknik, qPCR, er almindeligt accepteret som et middel til måling af telomerlængden til epidemiologiske undersøgelser <suP class = "xref"> 16 på grund af dets høje gennemstrømning, lave omkostninger og krav til små mængder DNA sammenlignet med andre metoder. Imidlertid kan qPCR kun måle gennemsnitligt telomerisk DNA-indhold i forhold til et enkeltkopieringsgen og er således et indirekte estimat af gennemsnitlig telomerlængde. Det giver også en høj variationskoefficient i sammenligningsstudier sammenlignet med sydlige blots, hvilket fører til tvivlsom nøjagtighed 21 .
TRF-proceduren har sine egne mangler, der begrænser brugen af det til nogle undersøgelser. TRF-teknikker kræver en stor mængde DNA sammenlignet med andre metoder (mellem 2 og 3 μg pr. Prøve). Dette begrænser teknikens anvendelser til at undersøge telomererlængden af kliniske prøver, for hvilke tilstrækkeligt genomisk DNA kan opsamles og kan ikke anvendes på nedbrydede DNA-prøver. Derudover er TRF-analysen kostbar og arbejdskrævende, hvilket kræver 4-5 dage for at give resultater. Imidlertid giver TRF en lav variationskoefficientGiver reproducerbarhed. Mens denne protokol er forskellig fra den traditionelle Southern blot (udnyttelse af in situ gel hybridisering), er de to teknikker grundlæggende de samme.
Teknikken præsenteret her er en kombination af en Southern blot og in-gel hybridisering; Associering af DNA-denatureringstrinnet fra Southern blots med in-gel hybridiseringen. Denne kombination har den ekstra fordel ved forbedret sondesignalstyrke sammenlignet med Southern blot og har konsekvent givet kvantificerbare resultater inden for vores laboratorium. Desuden giver anvendelsen af radioaktive sonder snarere end kemiluminescerende prober højere signalintensitet og giver mulighed for visualisering og kvantificering med en phosphorimager, hvilket gør analyserne af TRF brugervenlige.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter elektroforese er det genomiske DNA-smear højere end 800 bp. Dette kan ske, hvis restriktionsenzymerne er defekte, eller hvis der kræves yderligere enzymer (som beskrevet ovenfor). En anden mulig forklaring er, at proteinet stadig er bundet til DNA'et. Ved bestemmelse af DNA-koncentrationen ved spektrofotometer bør 260/280 forholdet være omkring 1,8. Hvis dette forhold er <1,5, er der proteinforurening, der kan forstyrre restriktionsenzymfordøjelsen. Enten ville DNA-prøven være nødvendigt at blive is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtten fra University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology fælles facilitet, der delvist understøttes ved tildeling P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
