Análise de fragmentos de restrição de terminal modificada para quantificar o comprimento de Telomere usando a hibridação em gel
Summary
Neste artigo, discute-se um protocolo detalhado para quantificar o comprimento do telômetro usando uma análise do fragmento de restrição terminal modificada que fornece uma medição direta rápida e eficiente do comprimento do telômero. Esta técnica pode ser aplicada a uma variedade de fontes celulares de DNA para quantificar o comprimento dos telômeros.
Abstract
Existem várias técnicas diferentes para medir o comprimento dos telômeros, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens. A abordagem tradicional, análise do Fragmento de Restricção de Telomere (TRF), utiliza uma técnica de hibridação de DNA, por meio da qual as amostras de DNA genômico são digeridas com enzimas de restrição, deixando para trás as repetições de DNA de telómero e algum DNA sub-telomérico. Estes são separados por electroforese em gel de agarose, transferidos para uma membrana filtrante e hibridizados com sondas oligonucleotídicas etiquetadas com quimioluminiscência ou radioactividade para visualizar fragmentos de restrição telomere. Esta abordagem, ao mesmo tempo que exige uma maior quantidade de DNA do que outras técnicas como a PCR, pode medir a distribuição do comprimento dos telômeros de uma população de células e permite a medição expressa em kilobases absolutas. Este manuscrito demonstra um procedimento de hibridação de DNA modificado para determinar o comprimento do telômero. O DNA genômico é digerido pela primeira vez com enzimas de restrição (que não cortamTelômeros) e separados por eletroforese em gel de agarose. O gel é então seco e o ADN é desnaturado e hibridado in situ com uma sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridização in situ evita a perda de DNA dos telómeros e melhora a intensidade do sinal. Após a hibridação, os géis são criados utilizando telas de fósforo e o comprimento do telômero é quantificado usando um programa gráfico. Este procedimento foi desenvolvido pelos laboratórios dos Drs. Woodring Wright e Jerry Shay na Universidade do Texas Southwestern 1 , 2 . Aqui, apresentamos uma descrição detalhada deste procedimento, com algumas modificações.
Introduction
Telomeres, situados nas extremidades dos cromossomos, são repetições nucleotídicas da sequência TTAGGG (nos cromossomos humanos) que desempenham um papel crítico na proteção da informação genética celular 3 , 4 , 5 . Os telômeros são vários milhares de pares de bases e servem para proteger a integridade do resto do cromossomo durante a replicação do DNA. A replicação de cromossomos não é perfeita, resultando nas extremidades do cromossomo não serem completamente copiadas. Essa ineficiência na replicação é denominada "problema de replicação final" e resulta na perda de algumas das repetições de telômeros durante cada rodada de replicação 6 , 7 . O comprimento do Telomere pode ser restaurado após a divisão celular pela telomerase, uma enzima que substitui as sequências de telómeros perdidos 8 , 9 . A Telomerasa, no entanto, não éAtivado na maioria das células somáticas humanas e, como resultado, ao longo do tempo, os telômeros encurtarão, resultando em senescência celular 10 . Devido ao encurtamento de telomere, os telômeros são considerados como um biomarcador do envelhecimento e risco de doenças relacionadas com a idade 11 , 12 . Além disso, o comprimento do telómero pode ser afetado por fatores genéticos, ambientais e de estilo de vida e outros estímulos como o estresse oxidativo, indicando que o comprimento dos telômeros pode desempenhar um papel como biomarcador em estudos toxicológicos, epidemiológicos e comportamentais 13 , 14 , 15 .
Este artigo demonstra uma técnica para medir o comprimento do telômero usando uma análise de fragmento de restrição terminal modificada (TRF) adaptada de Mender e Shay 2 e Kimura et al. 16 , e semelhante a Herbert, Shay e WrigHt 1 e Haussmann e Mauck 17 . Tradicionalmente, a análise TRF envolve um procedimento Southern Blot. As transferências de Southern são consideradas como "padrão de ouro" para o estudo do comprimento dos telômeros e são ativamente usadas para examinar o comprimento dos telócitos dos leucócitos em estudos de epidemiologia 18 . Esta análise TRF usa DNA genômico digerido deixando atrás as repetições de telômeros. Os fragmentos de DNA são então separados por eletroforese em gel, desnaturados e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As sequências de telômeros são hibridizadas com uma sonda oligonucleotídica telomereira. Em vez de transferir os telômeros separados para uma membrana, outras técnicas de TRF usam técnicas de hibridação em gel com e sem desnaturação do DNA. A inclusão da desnaturação é importante quando se considera a detecção de telômeros intersticiais, que foram relatados em algumas espécies 19 . Os procedimentos que não possuem etapas desnaturantes apenas detectamE as gotas de DNA de cadeia simples em telômeros terminais e não se ligam a seqüências de telômeros intersticiais 18 .
Além da análise TRF, existem várias outras técnicas para medir o comprimento do telômero, que cada uma tem suas próprias vantagens e desvantagens. A técnica Flow-FISH pode medir o comprimento médio do telômero de células individuais de um tipo de célula distinto usando citometria de fluxo 16 , 20 . Embora possa marcar com precisão os telômeros com sondas altamente específicas e reduzir o erro humano através da automação, o Flow-FISH é caro, menos eficiente e requer amostras frescas e um técnico altamente qualificado, limitando sua capacidade de estudos epidemiológicos 16 . Além disso, esse método não explica mudanças potenciais no número de cromossomos na população celular. Outra técnica, qPCR, é amplamente aceita como meio de medir o comprimento dos telômeros para estudos de epidemiologia <suP class = "xref"> 16 devido ao seu alto rendimento, baixo custo e exigência de pequenas quantidades de DNA em comparação com outros métodos. No entanto, qPCR só pode medir o conteúdo médio de DNA telomérico em relação a um gene de cópia única e, portanto, é uma estimativa indireta do comprimento médio dos telômeros. Ele também produz um alto coeficiente de variância em estudos de comparação, em comparação com manchas do sul, levando a uma precisão questionável 21 .
O procedimento TRF tem suas próprias deficiências que limitam seu uso para alguns estudos. As técnicas TRF requerem uma grande quantidade de DNA em comparação com outros métodos (entre 2 e 3 μg por amostra). Isto limita as aplicações da técnica ao exame do comprimento do telômero de amostras clínicas para as quais pode ser coletado DNA genômico suficiente e não pode ser usado em amostras de DNA degradadas. Além disso, a análise TRF é dispendiosa e intensiva em mão-de-obra, exigindo 4-5 dias para produzir resultados. No entanto, o TRF produz um baixo coeficiente de variaçãoConcedendo sua reprodutibilidade. Embora este protocolo seja diferente do tradicional Southern Blot (utilizando hibridação em gel in situ ), as duas técnicas são fundamentalmente as mesmas.
A técnica apresentada aqui é uma combinação de uma transferência de Southern e hibridação em gel; Associando o passo de desnaturação do DNA de Southern Blots com a hibridação em gel. Esta combinação tem o benefício adicional da intensidade do sinal da sonda melhorada em comparação com o Southern Blot e produziu consistentemente resultados quantificáveis dentro do nosso laboratório. Além disso, o uso de sondas radioativas ao invés de sondas quimioluminescentes produz maior intensidade de sinal e permite a visualização e quantificação com um agente de fosforilação, tornando as análises do TRF fáceis de usar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Após a eletroforese, o esfregaço de DNA genômico é superior a 800 pb. Isso pode ocorrer se as enzimas de restrição estiverem com defeito ou se forem necessárias enzimas adicionais (conforme descrito acima). Uma segunda explicação possível é que a proteína ainda está ligada ao DNA. Ao determinar a concentração de DNA por espectrofotômetro, a razão 260/280 deve ser em torno de 1,8. Se essa proporção for <1,5, existe uma contaminação protéica que pode interferir com a digestão das enzimas de restr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio da unidade compartilhada de Oncologia Biobehavioral do Instituto de Câncer da Universidade de Pittsburgh que é apoiada em parte pelo prêmio P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
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