इन-जेल हाइब्रिडिजेशन का इस्तेमाल करते हुए टेलीमोएरे की मात्रा को बढ़ा देने के लिए संशोधित टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा विश्लेषण
Summary
इस अनुच्छेद में, एक संशोधित टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा विश्लेषण का उपयोग करके टेलोमोरे लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर चर्चा की गई है जो टेलीमोरे लंबाई के तेज और कुशल प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है। यह तकनीक टेलोमोरे लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए डीएनए के विभिन्न सेल स्रोतों पर लागू की जा सकती है।
Abstract
टेलोमोरे की लंबाई को मापने के लिए कई अलग-अलग तकनीकों हैं, प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान के साथ पारंपरिक दृष्टिकोण, टेलोमेरे प्रतिबंध फ्रेगमेंट (टीआरएफ) विश्लेषण, एक डीएनए संकरण तकनीक का उपयोग करता है जिससे जीनोमिक डीएनए नमूने पाचन एंजाइमों के साथ पच रहे हैं, टेलमोरे डीएनए पुनरावृत्तियों और कुछ उप-टेलोरोमिक डीएनए को छोड़कर। इन्हें agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है, एक फिल्टर झिल्ली को स्थानांतरित किया जाता है और ऑल्गोन्यूक्लियोटाइड जांच के लिए हाइब्रिज्ड किया जाता है, या तो कैममिलाइनेसिसेंस या रेडियोधर्मिता के साथ टेल्मोरे प्रतिबंध प्रतिबंधों को कल्पना करता है। पीसीआर जैसे अन्य तकनीकों की तुलना में डीएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, तो यह दृष्टिकोण कोशिकाओं की आबादी के टेलोमोरे लंबाई वितरण को माप सकता है और पूर्ण किलोबाज़ में अभिव्यक्त माप को अनुमति देता है। यह पांडुलिपि टेलीमोरे लंबाई का निर्धारण करने के लिए संशोधित डीएनए संकरण प्रक्रिया को दर्शाता है। जीनोमिक डीएनए पहले प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पच जाता है (जो कटौती नहीं करते हैंTelomeres) और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग। जेल तब सूख जाता है और डीएनए विकृत और रेडियोलैबैड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के लिए स्वस्थानी रूप में संकरित होता है । यह स्वस्थानी संकरण में टेलोमरे डीएनए के नुकसान से बचा जाता है और संकेत तीव्रता में सुधार करता है। हाइब्रिडिजेशन के बाद, जैल को फॉस्फोर स्क्रीन के उपयोग से चित्रित किया जाता है और टेलोमरे लम्बाई ग्राफ़िंग प्रोग्राम का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जाती है। यह प्रक्रिया डीआरएस के प्रयोगशालाओं द्वारा विकसित की गई थी। वुडिंग राइट और जैरी शय टेक्सास विश्वविद्यालय के दक्षिणपश्चिमी 1 , 2 यहां, हम कुछ संशोधनों के साथ, इस प्रक्रिया का विस्तृत वर्णन प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
गुणसूत्रों के सिरों पर स्थित टेलोमेरेस अनुक्रम TTAGGG (मानव क्रोमोसोम पर) की न्यूक्लियोटाइड दोहराता है जो सेलुलर आनुवंशिक जानकारी 3 , 4 , 5 की सुरक्षा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टेलोमेरेस लंबाई में कई हजार जोड़े हैं और डीएनए प्रतिकृति के दौरान बाकी गुणसूत्रों की अखंडता की रक्षा के लिए काम करते हैं। गुणसूत्रों की प्रतिकृति सही नहीं है, जिसके परिणामस्वरूप गुणसूत्र के छोर पूरी तरह से प्रतिलिपि नहीं किए जा रहे हैं। प्रतिकृति में इस अक्षमता को "अंत-प्रतिकृति समस्या" कहा जाता है और इसके परिणामस्वरूप कुछ खुराक 6 , 7 के दौरान प्रत्येक टेलेमोरे के दोहराव के नुकसान में परिणाम मिलता है। टेलोमेरेस द्वारा सेल डिवीजन के बाद टेलोमेरे की लंबाई बहाल की जा सकती है, एंजाइम खो गया टेलोमरे दृश्य 8 , 9 की जगह लेता है। टेलोमेरेस, हालांकि, नहीं हैज्यादातर मानव दैहिक कोशिकाओं में सक्रिय होता है और नतीजतन, समय के साथ, टेलोमोरेस कम हो जाएगा, अंततः सेलुलर सेलनेस 10 में परिणाम होगा। टेलोमरे को छोटा करने के कारण, telomeres उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों का खतरा biomarker के रूप में माना जाता है 11 , 12 इसके अतिरिक्त, टेलोमोरे लंबाई आनुवंशिक, पर्यावरण और जीवन शैली के कारकों और ऑक्सीडेटिव तनाव जैसे अन्य उत्तेजनाओं से प्रभावित हो सकती है, यह दर्शाता है कि टेलोमोरे लंबाई विषैविक, महामारी विज्ञान और व्यवहारिक अध्ययनों में जैवमार्कर के रूप में एक भूमिका निभा सकते हैं 13 , 14 , 15 ।
यह आलेख एक संशोधित टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा (टीआरएफ) विश्लेषण का उपयोग करके टेलोमरे लम्बाई को मापने के लिए एक तकनीक को दर्शाता है जो कि मेन्डर और शै 2 और किमुरा एट अल 16 , और हर्बर्ट, शे और रेग के समानएचटी 1 और हाउसमैन और मॉक 17 परंपरागत रूप से, टीआरएफ विश्लेषण में एक दक्षिणी दाग प्रक्रिया शामिल है। दक्षिणी ब्लोट को टेलोमोरे की लंबाई के अध्ययन के लिए "सोना-मानक" माना जाता है और महामारी विज्ञान के अध्ययन में ल्यूकोसाइट टेलोमोरे लंबाई की जांच के लिए सक्रिय रूप से उपयोग किया जाता है। यह टीआरएफ विश्लेषण टेस्टोमोर दोहराव के पीछे छोड़ने वाला पचाने वाला जीनोमिक डीएनए का उपयोग करता है। डीएनए टुकड़े तब जेल वैद्युतकणसंचलन से अलग हो जाते हैं, विकृत हो जाते हैं और एक नाइट्रोकेल्यूलोज झिल्ली को स्थानांतरित कर दिया जाता है। टेलोमेरे दृश्यों को एक टेलोमेरे ऑलिगोनक्लियोटाइड जांच के लिए हाइब्रिज्ड किया गया है। अलग-अलग टेल्मोरेस को झिल्ली तक स्थानांतरित करने के बजाय, अन्य टीआरएफ तकनीक डीएनए के बिना और बिना-बिना जेल संकरण तकनीकों का उपयोग करते हैं। अंतराल टेलोमोरेस का पता लगाने पर दोषपूर्णता को शामिल करना महत्वपूर्ण है, जो कि कुछ प्रजातियों में 19 की सूचना मिली है। कार्यवाही की कमी के कारण केवल वें का पता लगाया जा सकता हैटर्मिनल टेलोमेरेस पर एकल फंसे हुए डीएनए ओवरहेन्ज और इंटरस्टिस्टिकल टेलोमरे दृश्य 18 में बाँध नहीं करेंगे।
टीआरएफ़ विश्लेषण के अलावा, टेमोमोरे की लंबाई को मापने के लिए कई अन्य तकनीकें हैं, जिनमें प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं। फ्लो-फिश तकनीक फ्लो साइमेट्रेट्री 16 , 20 का उपयोग करते हुए एक विशिष्ट सेल प्रकार की व्यक्तिगत कोशिकाओं के औसत टेलोरोमीटर लंबाई को माप सकती है। हालांकि यह सटीक रूप से उच्च विशिष्ट जांच वाले टेल्मोरेस को टैग कर सकता है और स्वचालन के माध्यम से मानव त्रुटि को कम कर सकता है, फ्लो-एफआईएसएच महाग, कम कुशल है और ताजा नमूनों और अत्यधिक कुशल तकनीशियनों की आवश्यकता है, जिसमें महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए अपनी क्षमता सीमित है 16 । इसके अलावा, यह विधि सेल आबादी में गुणसूत्रों की संख्या में संभावित परिवर्तन के लिए खाता नहीं है। एक अन्य तकनीक, qPCR, महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए टेलोमोरे लंबाई को मापने के साधन के रूप में व्यापक रूप से स्वीकृत है <suअन्य तरीकों के मुकाबले छोटी मात्रा में डीएनए के लिए इसकी उच्च-थ्रुपुट, कम लागत और आवश्यकता के कारण पी वर्ग = "एक्सएएफ"> 16। हालांकि, qPCR केवल एक प्रतिलिपि जीन के सापेक्ष औसत टेलोरोमेरिक डीएनए सामग्री को माप सकता है और इस प्रकार, औसत टेलोमोरे लंबाई का एक अप्रत्यक्ष अनुमान है। यह दक्षिणी ब्लोटों की तुलना में तुलनात्मक अध्ययनों में भिन्नता का एक उच्च गुणांक भी पैदा करता है, जिससे संदेहास्पद सटीकता 21 हो सकती है ।
टीआरएफ प्रक्रिया की अपनी कमियां हैं जो कुछ अध्ययनों के लिए इसका उपयोग सीमित करती हैं। टीआरएफ तकनीकों को अन्य तरीकों (2 से 3 μg प्रति नमूना के बीच) की तुलना में डीएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। यह चिकित्सीय नमूनों की टेलोमोरे लंबाई का परीक्षण करने के लिए तकनीक के अनुप्रयोगों को सीमित करता है जिसके लिए पर्याप्त जीनोमिक डीएनए एकत्र किया जा सकता है, और अपमानजनक डीएनए नमूनों पर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, टीआरएफ़ विश्लेषण महंगा और परिश्रम श्रमिक है, परिणाम प्राप्त करने के लिए 4-5 दिनों की आवश्यकता होती है। हालांकि, टीआरएफ़ भिन्नता का एक कम गुणांक पैदा करता हैअपनी प्रजनन क्षमता प्रदान करना हालांकि यह प्रोटोकॉल परंपरागत दक्षिणी दाग ( सीटू जेल संकरण में उपयोग) से भिन्न है, दो तकनीकों मौलिक रूप से समान हैं।
यहां प्रस्तुत तकनीक एक दक्षिणी धब्बा और इन-जेल संकरण का संयोजन है; इन-जेल संकरण के साथ दक्षिणी ब्लोट से डीएनए denaturing चरण जोड़ना। इस संयोजन में दक्षिणी धब्बों की तुलना में बेहतर जांच सिग्नल की ताकत के अतिरिक्त लाभ हैं और हमारी प्रयोगशाला में लगातार मात्रात्मक परिणाम उत्पन्न हुए हैं। इसके अतिरिक्त, रसायनमितीय जांच के बजाय रेडियोधर्मी जांच का उपयोग उच्च संकेत तीव्रता पैदा करता है और फॉस्फोरिमेगर के साथ विजुअलाइजेशन और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, जो टीआरएफ उपयोगकर्ता के अनुकूल के विश्लेषण करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन, जीनोमिक डीएनए धब्बा 800 बीपी से अधिक है यह तब हो सकता है यदि प्रतिबंध एंजाइमों में दोषपूर्ण होते हैं या यदि अतिरिक्त एंजाइम (जैसा ऊपर वर्णित है) की आवश्यकता होती है। दूसरा संभ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने पिट्सबर्ग कैंसर इंस्टीट्यूट की बायोबाहैवैयेशनल ऑन्कोलॉजी विश्वविद्यालय की सुविधा का समर्थन स्वीकार किया है जो कि पुरस्कार पी 30 सीए047 9 04 द्वारा भाग में समर्थित है
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
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