Identifiering av kvarvarande givare erytroid stamceller efter hematopoetisk stamcellstransplantation för patienter med Hemoglobinopathies
Summary
Kvantifiering av givare-derived celler krävs för att övervaka engraftment efter stamcellstransplantation hos patienter med hemoglobinopathies. En kombination av flow flödescytometri-baserade cell sortering, koloni bildandet assay och efterföljande analys av kort tandem repetitioner kan användas för att bedöma spridning och differentiering av stamfäder i erytroid facket.
Abstract
Förekomsten av ofullständig chimärism noteras i en stor andel av patienter efter benmärgstransplantation för thalassemi större eller sicklecellanemi. Denna observation har oerhörda konsekvenser, som efterföljande terapeutiska immunmodulering strategier kan förbättra kliniska resultat. Konventionellt, används polymerasen kedjar reaktion-baserad analys av short tandemupprepningar för att identifiera chimärism givare-derived blodkroppar. Men denna metod är begränsad till kärnförsedda celler och inte kan skilja mellan dissocierade encelliga härstamningar. Vi tillämpade analys av short tandemupprepningar flöda flödescytometrisk-sorterade hematopoetiska stamceller och jämfört detta med analysen av short tandemupprepningar som erhållits från utvalda burst-forming unit – erytroid kolonier, och båda samlas in från benet märg. Med denna metod kan vi demonstrera olika proliferation och differentiering av givare celler i erytroid facket. Denna teknik är berättigad att slutföra nuvarande övervakning av chimärism i den stamcellstransplantation inställning och kan således vara tillämpad i framtiden kliniska studier, stamcellsforskning och design av genterapeutiska prövningar.
Introduction
Allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) är endast tillgängliga läkande metod för en mängd olika medfödda genetiska störningar i det hematopoetiska systemet, att uppnå sjukdomsfri överlevnad på mer än 90% för annars mycket äventyras och begränsad livslängd patienter1. Effekten av detta viktiga terapeutiska verktyg har optimerats genom att begränsa toxiciteten av pre- och efter transplantation regimer2, men också genom insatser som syftar till att upprätthålla stabil transplantatfunktion, som kvantifieras genom noggrann övervakning av givare-derived celler3,4,5.
I allmänhet, innebär komplett chimärism (CC) total ersättning av lymphohematopoietic facket av givare-derived celler, medan begreppet mixed chimärism (MC) används när givare – och mottagare-härledda celler förekommer samtidigt i olika proportioner. Split chimärism (SC) betecknar samexistens av mixed chimärism hos encelliga härstamningar, såsom i erytroid facket. Snabb bestämning av chimärism status efter HSCT är kritisk, eftersom det kan bidra till att identifiera patienter som är mottagliga för återfall och inleda efterföljande immunmodulerande strategier, såsom donator lymfocyt infusioner eller minskning av immunsuppressiva terapier6.
Flera metoder har utvecklats för att övervaka engraftment efter HSCT. Isotyping av immunglobuliner och analys av cytogenetik har dålig känslighet och är begränsad i sin förmåga att upptäcka polymorfism7,8. Införandet av fluorescerande i situ hybridisering (FISH) kan förbättra känsligheten i chimärism övervakning efter HSCT, men är begränsad till sex-felaktigt organtransplantationer9. För närvarande, polymeras-kedjereaktion (PCR) är den mest utbredda metoden som används för att upptäcka chimärism och bygger på konventionell agaros-akrylamid gelelektrofores av variabeln antal tandemupprepningar (VNTRs) eller kort tandem upprepas (misstänkta). Rutinmässigt används är kvantitativa PCR kunna upptäcka en extremt liten andel av kvarvarande donatorcellerna efter HSCT. Den största begränsningen av studierna hittills är att MC upptäckt är nästan uteslutande begränsad till närvaro av kärnförsedda celler, i stället för mogna erytrocyter, nämligen celler att är funktionellt avgörande för patienter drabbade av hemoglobinopathies. Hos patienter med olika blodgrupper är det värt att komma ihåg att cytofluorometric analys är att identifiera chimärism röda blodkroppar genom att utnyttja monoklonala antikroppar riktade mot erytrocyt antigenerna ABO och C, c, D, E och e10 , 11. ett annorlunda, men mycket intressant sätt att bedöma chimärism i erytroid släktlinje är kombinationen av flöde flödescytometrisk sortering av erytroid stamfäder och val av olika erytroid stamceller typer av odling i clonogenic analyser, följt av analys av STR12. Detta tillvägagångssätt är kunna kvantifiera relativa andelar av givare-kontra-mottagare chimärism i erytroid facket och kan utnyttjas i strategin för att upprätthålla benmärgen graften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med den aktuella studien är att ge publiken en kombination av två metoder för analysera givare/mottagare chimärism i erytroid föräldraparets efter HSCT hos patienter som behandlas för hemoglobinopathies: 1.) fluorescens-aktiverad cell sortering av hematopoetiska stamceller i benmärgen prov följt av analys av short tandemupprepningar och 2.) kolonibildande enhet växer av benmärgsceller, klassificering av kolonier i olika stamceller följt av analys av short tandemupprepningar. Nyhet i denna strategi ligg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
