Påvisning av rester Donor Erythroid Progenitor celler etter blodkreft stamcelletransplantasjon for pasienter med Hemoglobinopathies
Summary
Kvantifisering av donor-avledet celler er nødvendig for å overvåke engraftment etter stamcelletransplantasjon hos pasienter med hemoglobinopathies. En kombinasjon av flyt cytometri-baserte celle sortering, koloni formasjon analysen og påfølgende analyse av kort tandem gjentar kan brukes til å vurdere spredning og differensiering av progenitors i erythroid rommet.
Abstract
Tilstedeværelsen av ufullstendig chimerism er nevnt i en stor andel av pasienter etter benmarg transplantasjon for talassemi store eller sigdcelleanemi. Denne observasjonen har enorme implikasjoner, som etterfølgende terapeutiske immunomodulation strategier kan forbedre kliniske utfallet. Konvensjonelt, brukes polymerase kjedereaksjon-basert analyse av kort tandem gjentar til å identifisere chimerism i donor-avledet blodlegemer. Men denne metoden er begrenset til kjerne celler og ikke kan skille mellom dissosiert encellede overleveringslinjer. Vi søkt analyse av kort tandem gjentar å strømme cytometric-sortert blodkreft stamfar celler og sammenlignet dette med analyse av kort tandem gjentar fra valgt burst-forming enhet – erythroid kolonier, begge fra benet benmarg. Med denne metoden er vi i stand til å demonstrere ulike spredning og differensiering av donor cellene i erythroid rommet. Denne teknikken er kvalifisert til å fullføre gjeldende overvåking av chimerism i det stilk celle transplantasjonen innstilling, og dermed kan være brukt i fremtiden kliniske studier, stamcelleforskning og design av gene terapi studier.
Introduction
Allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (HSCT) er bare tilgjengelig helbredende tilnærming for en rekke medfødt genetiske lidelser av blodkreft systemet, oppnå sykdomsfri overlevelse av mer enn 90% for ellers svært svekket og livet-begrenset pasienter1. Effekten av dette viktige terapeutiske verktøyet er optimalisert ved å begrense toksisitet av pre- og etter transplantasjon regimer2, men også av intervensjoner rettet opprettholde stabil pode-funksjonen, som er kvantifisert ved tett oppfølging av donor-avledet celler3,4,5.
Generelt, innebærer komplett chimerism (CC) total utskifting av lymphohematopoietic kupé av donor-avledet celler, mens begrepet blandet chimerism (MC) brukes når donor – og mottaker-avledet celler finnes samtidig i forskjellige proporsjoner. Delt chimerism (SC) betegner en sameksistens av blandet chimerism observert i én celle linjene, som i erythroid rommet. Spør fastsettelse av chimerism status etter HSCT er kritisk, som det kan bidra til å identifisere pasienter utsatt for sykdommen tilbakefall og starte etterfølgende immunmodulerende strategier, som giver lymfocytt infusjoner eller reduksjon av suppressive terapi6.
Flere metoder har blitt utviklet for å overvåke engraftment etter HSCT. Isotyping av immunglobuliner og analyse av cytogenetics har dårlig følsomhet og begrenset i sin evne til å oppdage polymorfisme7,8. Innføring av fluorescerende i situ hybridisering (fisk) kan forbedre følsomhet chimerism overvåke etter HSCT, men er begrenset til sex-feil allografts9. Foreløpig polymerasekjedereaksjons (PCR) er den vanligste metoden brukes til å oppdage chimerism og er basert på konvensjonelle agarose-akrylamid gel geleelektroforese av variabelt antall tandem gjentar (VNTRs) eller kort tandem gjentar (STRs). Rutinemessig brukes er kvantitative PCR kjøpedyktig merker en svært liten andel av rester donor cellene etter HSCT. Stor begrensning av studiene så langt er at MC gjenkjenning er nesten utelukkende begrenset til tilstedeværelsen av kjerne celler, i stedet for eldre erytrocytter, nemlig celler at funksjonelt viktig for pasienter påvirkes av hemoglobinopathies. Pasienter med ulike blodtypene er det verdt å huske at cytofluorometric analyse er identifisere chimerism i røde blod celler ved å benytte monoklonale antistoffer rettet mot de røde blodlegemer antigener ABO og C, c, D, E og e10 , 11. en annen, men veldig interessant måte å vurdere chimerism i erythroid avstamning er kombinasjonen av flyt cytometric sortering av erythroid progenitors og utvalg av ulike erythroid stamfar typer av dyrking i clonogenic analyser, etterfulgt av analyse STR12. Denne tilnærmingen er kunne kvantifisere relative proporsjonene i donor-versus-mottaker chimerism i erythroid skuffen og kan benyttes i strategien for å opprettholde bein margtransplantasjon graftet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne studien er å gi publikum en kombinasjon av disse metodene for analysere donor/mottaker chimerism i erythroid progenitors etter HSCT i pasienter behandlet for hemoglobinopathies: 1.) fluorescens-aktivert celle sortering blodkreft stamfar celler i benmargen prøver etterfulgt av analyse av kort tandem gjentar og 2.) Colony-forming enheten vokser beinmargen celleområde, klassifisering av koloniene i ulike stamfar etterfulgt av analyse av kort tandem gjentakelser. Nyheten av denne tilnærmingen ligger i å…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
