Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması
Summary
Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.
Abstract
Tam hücre yama kelepçesi, tekli hücrelerin elektriksel özelliklerini ölçmek için altın standart yöntemdir. Bununla birlikte, in vitro yama kelepçesi, karmaşıklığı ve kullanıcı operasyonu ve kontrolüne yüksek bağımlılığı nedeniyle zorlu ve düşük üretim tekniği kalmaktadır. Bu el yazması, akut beyin dilimlerinde in vitro tüm hücre yaması klemp deneyleri için görüntü yönlendirmeli bir otomatik tutma kelepçesi sistemini göstermektedir. Sistemimiz, floresan etiketli hücreleri algılamak ve bir mikromanipülatör ve dahili pipet basınç kontrolü kullanarak tam otomatik yama için onları hedeflemek için bir bilgisayar görme tabanlı algoritma uygular. Bütün süreç, insan müdahalesi için asgari gereklilikler ile son derece otomatiktir. Elektrik direnci ve dahili pipet basıncı da dahil olmak üzere gerçek zamanlı deney bilgileri gelecekteki analizler ve farklı hücre tiplerine göre optimizasyon için elektronik olarak belgelenmiştir. Sistemimiz akut beyin bağlamında tanımlansa daN dilim kayıtlarında, aynı zamanda ayrışmış nöronların, organotipik dilim kültürlerinin ve diğer nöronal olmayan hücre tiplerinin otomatik görüntü yönlendirmeli yama kelepçesine de uygulanabilir.
Introduction
Yama kenetleme tekniği ilk uyarılabilir membranların 1 iyonik kanal incelemek için 1970'lerde Neher ve Sakmann tarafından geliştirilmiştir. O zamandan beri, yama sıkıştırma, nöronlar, kardiyomiyositler, Xenopus oositleri ve yapay lipozomlar dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde hücresel, sinaptik ve devre seviyesinde – hem in vitro hem de in vivo – birçok farklı çalışmada uygulanmıştır 2 . Bu süreç, bir hücrenin doğru tanımlanması ve hedeflenmesi, hücreye yakın yama pipetini taşımak için karmaşık mikromanipülatör kontrolü, sıkı bir gigaseal yama oluşturmak için uygun zamanda pipete pozitif ve negatif basınç uygulanmasını, Ve tam hücreli bir yama konfigürasyonu oluşturmak için bir kırılma. Mandal sıkıştırma genellikle manuel olarak yapılır ve ustalık için kapsamlı eğitim gerektirir. Yama ile deneyimli bir araştırmacı için bileKelepçe, başarı oranı nispeten düşüktür. Daha yakın zamanda, patch-clamp deneylerini otomatikleştirmek için çeşitli girişimler yapılmıştır. Otomasyonu başarmak için iki temel strateji geliştirildi: yama sürecinin otomatik kontrolü ve yeni ekipmanların ve tekniğin baştan tasarlanmasını sağlamak için standart patch clamp ekipmanının güçlendirilmesi. Eski strateji, mevcut donanıma uyarlanabilir ve in vivo kör yama kelepçesi 3 , 4 , 5 , akut beyin dilimleri, organotipik dilim kültürlerinin in vitro yama kelepçesi ve kültürlenmiş ayrışmış nöronlar da dahil olmak üzere çeşitli yama kelepçesi uygulamalarında kullanılabilir 6 . Aynı anda birden çok mikromanipülatör kullanarak kompleks yerel devrelerin sorgulanmasını sağlar 7 . Düzlemsel yama yöntemi, yüksek verimli eşzamanlı p elde edebilen yeni kalkınma stratejisinin bir örneğidirİlaç tarama amaçları için askıdaki hücrelerin atch kelepçesi 8 . Bununla birlikte, düzlemsel yama yöntemi, özellikle uzun proseslere sahip nöronlar veya kapsamlı bağlantılar içeren sağlam devreler olmak üzere tüm hücre tipleri için geçerli değildir. Bu, geleneksel patch clamp teknolojisinin önemli bir avantajı olan sinir sisteminin karmaşık devre haritalarına uygulanmasını sınırlar.
Standart yama kelepçesi donanımını güçlendirerek elle yama klemp prosesini in vitro otomatik hale getiren bir sistem geliştirdik. Autopatcher IG sistemimiz, otomatik pipet kalibrasyonu, floresan hücre hedef belirleme, pipet hareketinin otomatik kontrolü, otomatik tam hücre yamalama ve veri günlüğü sağlar. Sistem, otomatik olarak farklı derinliklerde birden fazla beyin dilimi imgesi edinebilir; Bilgisayar vizyonu ile analiz edebilecek; Ve floresan etiketli hücrelerin koordinatları da dahil olmak üzere bilgi çıkarmak. Bu bilgiler daha sonraIlgilenilen hücreleri hedeflemek ve otomatik olarak düzeltmek için kullanılır. Yazılım, birkaç açık kaynak kütüphanesi kullanarak, özgür, açık kaynaklı bir programlama dili olan Python'da yazılmıştır. Bu, diğer araştırmacılara erişebilmesini sağlar ve elektrofizyoloji deneylerinin tekrarlanabilirlik ve titizliğini geliştirir. Sistem, modüler bir tasarıma sahiptir; böylece ek donanım, burada gösterilen mevcut sistemle kolayca arayüz oluşturabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, in vitro olarak otomatik görüntü yönlendirmeli yama tutma kayıtları için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlemin ana adımları aşağıda özetlenmiştir. Birincisi, bilgisayarla görme, mikroskop kullanılarak elde edilen bir dizi görüntü kullanarak pipetin ucunu otomatik olarak tanımak için kullanılır. Bu bilgi daha sonra mikroskop ile manipülatör koordinat sistemleri arasındaki koordinat dönüşüm fonksiyonunu hesaplamak için kullanılır. Bilgisayarla görme, flüoresan etik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehall Vakfı'ndan maddi destek için minnettarız. Değerli yorumları için Samuel T. Kissinger'e teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
