환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학
Summary
이 프로토콜은 chromogenic immunohistochemistry 및 ImageJ를 사용하여 glioblastoma 환자 절제술에서 종양 microenvironment 구성 요소를 정량적으로 식별하기 위해 개발되었습니다.
Abstract
종양의 미세 환경에 대한 관심이 증대됨에 따라 가장 치명적이고 가장 침습적 인 뇌암 인 아교 모세포종 환자의 표본에서 미세 환경 성분을 구체적으로 결정하는 방법을 개발하기 시작했습니다. 병이있는 조직을 정확하게 묘사하기 위해 정량적 방법이 유용 할뿐만 아니라 잠재적으로 더 정확한 예후, 진단 및 조직 공학 시스템과 대체물의 개발에 기여할 수 있습니다. 아교 모세포종에서, 소교 세포 및 성상 세포와 같은 신경 교세포는 병리학 자의 등급에 기초하여 불량한 예후와 독립적으로 상관되어왔다. 그러나, 이들 세포 및 다른 교세포 구성 요소의 상태는 정량적으로 잘 기술되어 있지 않다. 이러한 glial 세포를 표시하는 큰 프로세스로 인해 어려울 수 있습니다. 또한 대부분의 조직 학적 분석은 전체 조직 표본에 초점을 맞추거나 종양의 대부 분에만 초점을 맞 춥니 다.매우 이질적인 조직. 여기, 우리는 glioblastoma 환자의 종양 절제술의 종양 대량 및 인접 지역 내의 glial 세포의 인구를 식별하고 양적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 우리는 색소 성 면역 조직 화학을 사용하여 환자의 종양 절제술에서 glial 세포 집단을 확인하고 ImageJ는 각 glial 집단에 대한 염색의 비율 범위를 분석했습니다. 이러한 기술로 우리는 신경 교종 종양 미세 환경의 영역에 걸쳐 신경아 교세포를 더 잘 묘사 할 수 있습니다.
Introduction
아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 악성 뇌종양은 주변의 건강한 뇌 실질 1, 2에 기본 종양 부피에서 매우 확산 침공에 의해 특징입니다. 이 확산 침투는 종양을 완전히 절제하는 것을 특히 어렵게 만들고, 치료 후 남아있는 침입 암 세포는 피할 수없는 재발의 가장 흔한 원인입니다 2 , 3 , 4 . 이전에, 우리는 그러나 조금 GBM의 침략에 기여하는 복잡한 메커니즘에 대해 알려진, 확산 신경 교종 세포 침공 (5) 치료 도움이 될 억제 발견했다. 암 주변 종양 미세 환경, 또는 조직은,도 7은 여러 암 6 종양의 진행에 관여한다. 교 모세포종 종양 미세 환경, p관절염은 성상 세포, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포뿐만 아니라 세포 외 기질, 용해성 인자 및 생물 물리학 적 인자와 같은 다수의 신경교 세포를 구성하는 비교적 특징이 낮고 독특하게 복잡합니다. 실험적으로, 성상 세포 및 미세 아교 세포는 신경 교종의 진행과 침공 8, 9, 10을 증가시키는 것으로,하지만 원래 인간의 뇌의 미세 환경에있는 모든 신경 교세포의 구성을 알 수있다.
우리는 이전에 미세 환경 구성 요소가 glioblastoma microenvironment의 세포 구성 요소를 정량 분석하고 비례 위험 모델 11에 우리의 분석을 통합하여 환자의 생존을 예측할 수 있음을 보여주었습니다. 여기, 우리는 glioblastoma 환자에서 종양 대량 및 종양 절제의 인접 지역 내의 glial 세포의 인구를 식별하기위한 정량 분석 방법을 설명합니다에스. 우리는 각질 세포군에 대한 염색의 비율 적용 범위를 분석하기 위해 염색체 면역 조직 화학을 사용하여 신경 교세포 집단과 ImageJ를 확인했습니다. 커버리지 비율을 평가하면 세포, 특히 암세포와의 상호 작용에 의해 영향을받는 세포의 형태 학적 차이를 측정하기위한 간단한 측정이 가능합니다. 조직 병리학 적 염색을 정량화하기위한 이전의 연구는 항체 기반 면역 조직 화학 염색의 특이성을 이용하지 않는 헤 마톡 실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin) 12 또는 Masson 's trichrome 13 과 같은 표준 염색법을 사용한다. 우리의 방법은 glioblastoma 환자의 종양 절제술에서 glial 집단을 직접 정량화하기 위해 개발되었으며, 복잡한 glioblastoma microenvironment를 밝히기 위해 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 방법은 전통적인 chromogenic immunohistochemistry를 사용하여 염색 된 조직 학적 샘플을 분석하는 정량적 접근법입니다. 이 유형의 분석을위한 현재의 방법론은 유사한 염색 프로토콜과 독립적 인 병리학 자의 채점을 포함합니다. 이 방법은 신뢰할 만하다. 그러나 많은 응용에서 종양과 관련된 이질성에 대한 더 나은 이해와 생체 외 연구를위한 종양의 정확한 재현과 같은 세포 구성에 대한보다 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Drs. Fahad Bafakih와 Jim Mandell, 면역 조직 화학에 도움을 준 Garrett F. Beeghly, 심장 혈관 연구 센터 Histology Core 및 Biorepository and Tissue Research Facility, University of Virginia의 Biomolecular Analysis Facility에 대한 지원 샘플 수집, 면역 조직 화학 및 영상.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
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