Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient
Summary
Ce protocole a été développé pour identifier quantitativement les composants de micro-environnement de la tumeur dans les résections du patient au glioblastome utilisant l'immunohistochimie chromogène et ImageJ.
Abstract
Avec l'intérêt croissant pour le micro-environnement de la tumeur, nous nous sommes mis à développer une méthode pour déterminer spécifiquement les composants de micro-environnement dans les échantillons de patients de glioblastome, le cancer du cerveau le plus mortel et le plus invasif. Non seulement les méthodes quantitatives sont-elles bénéfiques pour décrire avec précision les tissus malades, mais peuvent également contribuer à un pronostic plus précis, au diagnostic et au développement de systèmes et de remplacements tissulaires. Dans le glioblastome, les cellules gliales, telles que la microglie et les astrocytes, ont été corrélées indépendamment avec un mauvais pronostic basé sur le classement des pathologistes. Cependant, l'état de ces cellules et d'autres composants des cellules gliales n'a pas été bien décrit de manière quantitative. Cela peut être difficile en raison des grands processus qui marquent ces cellules gliales. En outre, la plupart des analyses histologiques se concentrent sur l'échantillon de tissu global ou seulement dans la masse de la tumeur, par opposition à la délimitation de quantifications basées sur des régionsDans le tissu hautement hétérogène. Ici, nous décrivons une méthode pour identifier et analyser quantitativement les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales des patients atteints de glioblastome. Nous avons utilisé l'immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales dans les résections tumorales des patients et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. Avec ces techniques, nous sommes en mesure de mieux décrire les cellules gliales dans toutes les régions du micro-environnement de la tumeur du gliome.
Introduction
Le glioblastome (GBM), le cancer du cerveau le plus fréquent et le malin, se caractérise par une invasion très diffuse de la masse tumorale primaire dans le parenchyme 1 , 2 du cerveau sain environnant. Cette invasion diffuse rend la tumeur particulièrement difficile à résister pleinement, et les cellules cancéreuses envahissantes qui restent post-thérapeutique sont la raison la plus fréquente pour la récurrence inévitable 2 , 3 , 4 . Auparavant, nous avons constaté que l'invasion de cellules de gliome diffus était bénéfique sur le plan thérapeutique 5 , mais on sait peu de choses sur les mécanismes complexes contribuant à l'invasion GBM. Le micro-environnement tumoral, ou le tissu entourant le cancer, a été impliqué dans la progression des tumeurs dans de multiples cancers 6 , 7 . Le micro-environnement de la tumeur du glioblastome, en pArticulaire, est relativement sous-caractéristique et est exclusivement complexe, composée de cellules gliales multiples, telles que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes, ainsi que la matrice extracellulaire, les facteurs solubles et les facteurs biophysiques. D'une manière expérimentale, les astrocytes et la microglie ont montré une augmentation de la progression du gliome et de l'invasion 8 , 9 , 10 , mais la composition de toutes les cellules gliales dans le microenvironnement du cerveau humain natif est inconnue.
Nous avons déjà montré que les composants microenvironnaires peuvent prédire la survie du patient en analysant quantitativement les composants cellulaires du micro-environnement du glioblastome et en incorporant nos analyses dans un modèle de risques proportionnels 11 . Ici, nous décrivons la méthode d'analyse quantitative pour identifier les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales du patient au glioblastomeS. Nous avons utilisé l'immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. L'évaluation du pourcentage de couverture crée une mesure simple pour déterminer les différences morphologiques des cellules, en particulier celles affectées par les interactions avec les cellules cancéreuses. Des études antérieures pour quantifier la coloration histopathologique utilisent une coloration standard telle que l'hématoxyline et l'éosine 12 ou le trichrome de Masson 13 , qui ne profitent pas de la spécificité de la coloration par immunohistochimie à base d'anticorps. Notre méthode a été développée pour quantifier directement les populations de gliales dans les résections de tumeur du patient liées au glioblastome, que nous visons à utiliser pour élucider le micro-environnement complexe du glioblastome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre méthode proposée ici est une approche quantitative pour analyser des échantillons histologiques colorés en utilisant une immunohistochimie chromogène traditionnelle. La méthodologie actuelle pour ce type d'analyse comprend des protocoles de coloration similaires suivis d'un classement par des pathologistes indépendants. Cette méthode a été fiable, mais pour un certain nombre d'applications, une compréhension plus précise du maquillage cellulaire est nécessaire, comme une meilleure compréh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les Drs. Fahad Bafakih et Jim Mandell pour l'acquisition et l'identification des échantillons de patients, Garrett F. Beeghly pour l'assistance à l'immunohistochimie, et le Centre de recherche sur les biorestations et les tissus, le Centre de recherche cardiovasculaire et le Centre d'analyse biomoléculaire de l'Université de Virginie pour obtenir de l'aide avec L'acquisition d'échantillons, l'immunohistochimie et l'imagerie.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
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