Bestemmelse av sialsyre i lever og melkprøver av villtype og<em> CMAH</em> Knock-out Mus.
Summary
Vi beskriver en HPLC-basert metode for bestemmelse av N-acetylneuraminsyre og N-glykolylenuraminsyre i muselever og melk.
Abstract
CMAH (cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrehydroksylase) er ansvarlig for oksydasjonen av cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrer i pattedyr. Imidlertid kan mennesker ikke oksidere cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyre til cytidinmonofosfat-N-glykolylneuraminsyre på grunn av en primær exon-deletjon av CMAH- genet. For å forstå effektene og implikasjonene av mangel på CMAH-aktivitet mer detaljert, er en Cmah- knock-out-modell i mus av stor interesse for grunnleggende og anvendt forskning. Analysemetoden for å bestemme fenotypen til denne musemodellen er her beskrevet i detalj, og er basert på deteksjon av både N-acetylneuraminsyre og N-glykolylenuraminsyre i leveren og melk av vill-type og Cmah- knock-out-mus. Endogene sialinsyrer frigjøres og derivatiseres med o-fenylendiamin for å danne fluorogene derivater, som deretter kan analyseres ved HPLC. Den presenterte protokollen kan væreOgså søkt om analyse av melke- og vevsprøver fra forskjellige andre opprinnelser, og kan være nyttig for å undersøke nærings- og helseeffekter av N-glykolylneuraminsyre.
Introduction
N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og N-glykolylneuraminsyre (Neu5Gc) er de vanligste sialinsyrene i de fleste pattedyr 1 . Selv om det er i stand til å syntetisere Neu5Ac endogent, er mennesker ikke i stand til å produsere Neu5Gc på grunn av en primær ekson deletion på CMAH genet som koder for en CMP-Neu5Ac hydroksylase 2 , 3 . Imidlertid kan animalske matvarer være kostholdskilder til Neu5Gc 4 , 5 , 6 , som fører til produksjon av anti-Neu5Gc-antistoffer og dermed utløse en immunrespons mot Neu5Gc 7 . Denne diettvirkningen av Neu5Gc er mistenkt for å bidra til kronisk betennelse og ulike andre sykdommer 8 , 9 , 10 . For å forstå forståelsen av Neu5Gc i hUmans, er en dyremodell for den systematiske studien av virkningene av matbårne sialinsyrer, svært ønskelig. Selv om protokoller basert på polymerasekjedereaksjon (PCR) for analyse av knock-out-mus er veletablert og en praktisk måte for den genotypiske vurderingen, krever funksjonell analyse av fenotype på metabolsk nivå mer spesifikke analysemetoder. Fenotypen av en Cmah- knock-out-musemodell kan vurderes ved å isolere og analysere sammensetningen av sialinsyrer i lever- eller melkeprøver. Flere metoder for påvisning av sialinsyrer i animalsk vev har tidligere blitt rapportert: omsetning av sialinsyrer med resorcinol 11 eller tiobarbitursyre 12 resulterer i dannelsen av et kromoforisk produkt og kan enkelt analyseres ved hjelp av en platereaderbasert oppsett, men bare den totale sialiske Syreinnhold kan bestemmes. Alternativt ble analysen av sialinsyrer også beskrevet under anvendelse av gaskromatografi13 , MALDI-ToF massespektrometri 14 eller amperometriske metoder 15 . Imidlertid er de mest anvendte sialinsyreanalysemetoder basert på hydrolytisk frigjøring, etterfulgt av fluorescensderivatisering og etterfølgende høyytelsesvæskekromatografi 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her presenterte protokollen tillater fenotypisk vurdering av homozygote Cmah- knock-out-mus ved å analysere og kvantifisere de relative mengder av Neu5Gc av melk og leverprøver. Analysen ble utført ved bruk av en standard HPLC-oppsett med fluorescensdeteksjon. Det mest kritiske trinn i denne prosedyren er fremstilling av anionbytterkolonnene og utførelse av anionutvekslingskromatografi; Å avgjøre harpiksen riktig og å samle de riktige vaske- og elueringsfraksjonene tar litt øvelse.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av Natural Science Foundation of China (bevilgningsnummer 31471703, A0201300537 og 31671854 til JV og LL), og 100 Foreign Talents Plan (bevilgningsnummer JSB2014012 til JV).
Materials
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. +3)-+and+alpha(2+–>+6)-isomers.”>Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 –> 3)- and alpha(2 –> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
