JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Published: October 25, 2017
doi:
10.3791/56056
, , , , , , , ,
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I,Universität Leipzig

Summary

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

Abstract

תכונות מכאניות מורכבות, מבוסס פולימר חומר רך, כגון תאים או רשתות ביופולימרים, יכול להיות מובן במסגרת אף הקלאסית של פולימרים גמיש ולא של מוטות נוקשה. חוטים המשמש כבסיס להישאר פרושות עקב שלהם נעלם ללא עמוד שדרה נוקשות, אשר הוא לכמת דרך האורך ההתמדה (lp), אבל הם גם הפניה תרמית חזקה. נוקשות כיפוף סופיים שלהם מוביל מכניקה קולקטיבית ייחודי, לא טריוויאלי של רשתות בתפזורת, המאפשר הקמת פיגומים יציב על השברים בנפח נמוך תוך מתן רשת גדול מידות. העיקרון הבסיסי הזה נפוצה בטבע (למשל, תאים או רקמות), שמירה על איכות גבוהה בתוכן מולקולרית, ובכך להקל דיפוזיה או הובלה פעילה. בשל השלכות הביולוגי שלהם יישומים טכנולוגיים פוטנציאליים hydrogels מסתיימים, שהיו פולימרים semiflexible המחקר ניכר. עם זאת, חקירות מובנים נותר מאתגר מאז הם הסתמכו על פולימרים טבעיים, כגון חוטים אקטין, אשר אינם tunable בחופשיות. למרות מגבלות אלה, בגלל חוסר של פולימרים סינתטיים מכנית tunable, semiflexible, חוטים אקטין הוקמו מערכת מודל נפוץ. מגבלה משמעותית היא כי כמות מרכזי lp לא יכול להיות בחופשיות מכוון כדי לחקור את ההשפעה שלו על מבנים בצובר מאקרוסקופית. מגבלה זו נפתרה על ידי העסקת מבנית לתכנות צינוריות דנ א, המאפשר שינוי מבוקרת של הקשיחות נימה. הם נוצרו באמצעות עיצובים מבוסס-אריח, שבו קבוצה בדידה של גדילים משלימים חלקית hybridize במבנה הטבעת עם היקף דיסקרטית. טבעות אלו כוללים קצוות דביקים, המאפשר הפילמור יעיל לתוך חוטים מספר מיקרונים אורך, ולהציג קינטיקה הפילמור דומים כמו biopolymers טבעי. בשל המכניקה שלהם לתכנות, הצינורות האלה הם מגוונים, הרומן כלים לחקור את ההשפעה של lp בהמולקולה יחיד, כמו גם היקף בצובר. בניגוד אקטין חוטים, הם נשארים יציבים בשבועות, ללא ניוון הבולטים, הטיפול וסופן וזהובה.

Introduction

בשל התנהגויות מורכבות מופעל על-ידי תכונות מכניות הייחודי שלהם, פולימרים semiflexible הם אבני הבניין הבסיסיות של מרכיבי החיים. בניגוד פולימרים גמיש, פולימרים semiflexible לאמץ תצורה פרושות עקב שלהם נוקשות עמוד שדרה שאינו נעלם תוך שנותרו על תנודות תרמית חזקה1. לפיכך, מודלים סטוכסטיים גרידא ניתן להחילם על התנהגויות שלהם, כמו עם הקצוות של פולימרים גמיש לחלוטין או נוקשה. 3,4 2,מודל שרשרת תולעת כביכול פותחה כדי לכמת את נוקשות זו באמצעות lp, אשר הוא קבוע הדעיכה של המתאם משיק-משיק לאורך הלהט4. אם lp הוא להשוות אורך מתאר (lc) של חוט הלהט, הפולימר נחשב semiflexible1. מקביל והקטבים של אוהל, הסדרי שלהם רשתות או חבילות מייצבת את כל מערכת קולקטיבית על השברים בנפח נמוך, המוביל אל viscoelastic יוצא דופן מאפיינים5,6,7, 8,9. מבנים אלה מספקים בכללותו גבוהה elasticities mesh בגדלים10, שמירה על תקינות מכנית תוך עדיין הקלת המפזרת ותהליכים הובלה פעילה. מאפיין זה מתאים במיוחד עבור מערכות ביולוגיות כגון את שלד התא או את מטריצה חוץ-תאית, אך הוא גם משמש מזון-11,1,-הנדסה-12.

הולך מרכיבי החיים מעבר את משמעותם, חשוב לבחון באופן מקיף המאפיינים הפיזיים של מבנים אלה כדי יש את הכלים לפתח חומרים ביונים או hydrogels רומן. במונחים של פולימרים semiflexible, זה מרמז על הקביעה שיטתית של המאפיינים קולקטיבית של רשתות הנובע יחיד-פילמנט מאפיינים כגון lp והפיתוח של מסגרת תיאורטית תיאורי. במחקרים חלוצית, אקטין הסלולר ביופולימרים הוקמה מערכת מודל עבור פולימרים semiflexible והוא עדיין נחשב את תקן זהב5,13,14,15 , 16 , 17. עם זאת, מחקרים ממצה מוגבלות במערכת זו מאחר שהם קשורים למאפייני הטבועה של חלבון זה. גישות תיאורטיות שונות שכיוונתם בניין תיאור של ההתנהגויות מכני לא טריוויאלי ברמת יחיד-פילמנט, הובילו בעיקר שונים קנה מידה תחזיות עבור התלות של מישור אלסטיים לינאריים הטיה המודולוס, G 0 (קרי, “הגמישות” של הרשת), ריכוז (c), lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. בזמן הריכוז שינוי קנה מידה נגיש ניסויים עם מבוססי אקטין או מערכות אחרות דגם ובזמן תחזיות תיאורטיות היה בקפדנות לאמת13,16,24, 25, שינוי קנה מידה ביחס lp נותר נגיש השפעול. עם זאת, זו מגבלה משמעותית מאז lp הוא גם משתנה בלתי-תלוי מה הכמות המכונן של פולימרים semiflexible.

מגבלה זו המרכזי, טבעי המוטלים על-ידי קבוע lp של אקטין או פולימרים אחרים נגזר ביולוגית כגון קולגן לאחרונה נפתרה על ידי העסקת צינורות DNA מבוסס-אריח, אשר tunable תכונותיהם מכני 9 , 26 , 27 , 28. שייתכנו שינויים הארכיטקטורות של הצינורות (למשל, מספר שונה של DNA בוחרים קווצות בתוך הזירה היחידה) תשואה של ערכים שונים עבור lp, אשר ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, על-ידי ניתוח שפופרת אחת המשתנות או הערכת התצורות מעוקל של מספר צינורות מודבקת, כפי שתואר לעיל9,28. ניתוחים אלה חשף כי ערכיp lשל אוכלוסיות שונות צינור משתנות מעל סדר גודל אחד או יותר, טכניקות הערכה שונים להניב תוצאות עקביות9,28.

באופן מפתיע, גודל כולל הרמה אלסטי ליניארי הטיה מודולוס G0 הריכוז, lp דווחה להיות עקביים עם כל גישות תיאורטיות קודמות 9, בפרט הפגנת הרבה יותר תלות החזוי על lpחזק. ממצאים אלה מדגישים את הערך של מערכת מודל חדש ללמוד את התכונות המרכזיות של פולימרים semiflexible. העסקת n-סליל ה-DNA צינורות מרחיב באופן דרמטי את היקף החקירות האלה. לא רק יכולים lp להיות בחופשיות מגוונים מבלי לשנות את החומר הבסיסי, אבל הטבע לתכנות הטבועה של ה-DNA ניתן לאפשר בחינה שיטתית של רכיבים נוספים, כגון crosslinks או תהליכי מיתוג קינטי. בנוסף, הצינורות האלה הם מסיסים במים ויציב, בניגוד לרוב חלבונים, pH הולם ותנאי יוניים למשך מספר שבועות, ללא השפלה לזיהוי9.

להרכיב את הצינורות האלה, קבוצה בדידה של ה-DNA oligonucleotides משמש, שכל אחד מהם מכיל שתי קבוצות המחשבים חולקים רצפי הבסיס משלימים שני הגדילים הסמוכים (עקב רצפים ספציפיים, גדיל אחד לא יכול ליצור מבנים כמו סיכות לשיער). רצפים משלימים hybridize בצורה מחזורית, ויוצרים טבעות סגור, חצי חופפות של n מחוברים מקטעי כפול-הסליל (איור 1A ו- B). טופס אלה טבעות בקוטר דיסקרטית (איור 1C), ואת התצורה שלהם חופפות חצי חושף קצוות דביקים צירית משלימים בקצוות דביקים של טבעת אחרת. תוספת זו בררני של התאמת oligonucleotides מפעיל את הערמה של הטבעות, שמוביל הפילמור יעיל של צינורות סליל ה-DNA filamentous בגודל n (nHT). אורכי מתאר שלהם בדרך כלל למדוד מספר מיקרונים אורך, פריסתם אורך דומה לזו של אקטין חוטים9,26,27,28. הוכח עבור צינורות DNA דומה כי הם אכן מציגים הפילמור קינטיקה דומים לאלה של אקטין חוטים ו- microtubulesp class = “xref” > 29. בהתאם מספר n של גדילי DNA בודדים ממציא את המבנה הבסיסי טבעת, הארכיטקטורה nHT, וכן את היקף ואת קוטר, יכולים להיות מכאנית ופיקודית מגוונים. שימוש גדילי DNA יותר מגביר את היקף הטבעות/הצינורות, משתנה המתאימה הקפיצות תכונות מכאניות לערכים גבוהים יותר lp (איור 1C), המקביל קשיחות גבוהה יותר. בסולם mesoscopic, אלה ערכים גדולים יותר שלp lמתרגמים פחות כפופות הייצורים החיים בשל הקשיחות גבוה יותר (איור 1D ו- E).

Protocol

1-הכנת n HTs הערה: כאן, n מציין את מספר שונה גדילי DNA יחיד מעורב היווצרות הצינורות סליל בגודל מסוים. עבור n = 8, שמונה גדילי DNA שונה יחיד להמציא טבעת יחידה. רכישה DNA רצף (HPLC טוהר כיתה או גבוה יותר) מן סינתזה הדנ א מתאים שירות או לבצע סינתזה באיכות גבוהה, טיהור (למופ?…

Representative Results

ההרכבה של צינוריות הדנ א באמצעות רמפה טמפרטורה (איור 2) היא שיטה אמינה. כדי ליצור פולימרים semiflexible מלאכותיים אלה. פולימרים אלה בעלי מאפיינים דומים לכלים המקבילים המתרחשים באופן טבעי, כגון חוטים אקטין, אך מספק מסגרת ניסיונית הרבה יותר רחב שכן תכונות מכניות ש…

Discussion

כדי להשיג רשתות בנוי כראוי, בהרכבת הנאנו DNA היא צעד חיוני. שגיאות במהלך תהליך סינתזה השפעה שלילית על איכות צינור; לכן, מומלץ כי hplc, קורס או תהליך מחמירים יותר לשמש כדי לטהר את oligonucleotides. מאז היווצרות דיסקרטית במקום צינוריות DNA צבור, וכן הפצה האורך שלהם, תלוי סטויכיומטריה equimolar של oligonucleotides בוחר?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו להכיר מימון מאת DFG (1116/17-1), את לייפציג בבית הספר למדעי הטבע “BuildMoNa” (GSC 185). עבודה זו תמכה באמצעות הפרויקט פראונהופר Attract 601 683. T. H מאשר מימון הקרן החברתית האירופאית (ESF-100077106).

Materials

AFM cantilever ACTA AppNano
AFM – NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore – Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

DNA NanotubesSemiflexible PolymersSoft MatterBiopolymersFilamentsNetworksHydrogelsCell MigrationStiffnessRheologyDNA HybridizationDNA StrandsThermocyclerSample PreparationDynamic Shear RheometerSample LoadingEvaporation Prevention
check_url/56056?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image