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Bioengineering

Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

Published: October 25, 2017
doi:
10.3791/56056
, , , , , , , ,
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I,Universität Leipzig

Summary

Polimeri semiflessibili visualizzano proprietà meccaniche uniche che sono ampiamente applicato da sistemi viventi. Tuttavia, gli studi sistematici sui biopolimeri sono limitati poiché proprietà quali la rigidità del polimero sono inaccessibili. Questo manoscritto descrive come questa limitazione è aggirata mediante nanotubi di DNA programmabili, permettendo studi sperimentali sull’impatto della rigidità del filamento.

Abstract

Proprietà meccaniche del complessa, a base di polimeri materia soffice, come cellule o reti di biopolimero, può essere inteso in né la cornice classica di polimeri flessibili né di barre rigide. Filamenti sottostante rimangono tese a causa della loro rigidità non vanishing di spina dorsale, che è quantificato tramite la lunghezza di persistenza (lp), ma sono anche soggetti a forti fluttuazioni termiche. Loro rigidità alla flessione finiti conduce delle reti di massa, permettendo la formazione di ponteggi stabile alle frazioni di volume basso fornendo al contempo maglie di grandi dimensioni meccaniche collettivo unico, non banale. Questo principio di fondo è prevalente in natura (ad esempio, in cellule o tessuti), riducendo al minimo l’alto contenuto molecolare e facilitando in tal modo diffusivo o trasporto attivo. Grazie alla loro implicazioni biologiche e potenziali applicazioni tecnologiche in idrogel biocompatibile, polimeri semiflessibili sono state oggetto Studio considerevole. Tuttavia, le indagini comprensibile è rimasto impegnative poiché hanno contato su polimeri naturali, quali i filamenti dell’actina, che non sono liberamente sintonizzabili. Nonostante queste limitazioni e a causa della mancanza di polimeri sintetici, meccanicamente sintonizzabile e semiflessibili, filamenti di actina sono stati stabiliti come sistema modello comune. Una limitazione importante è che la quantità centrale lp non può essere liberamente ottimizzato per studiare il suo impatto sulle strutture macroscopiche alla rinfusa. Questa limitazione è stato risolto impiegando strutturalmente programmabili nanotubi di DNA, attivazione controllata alterazione della rigidezza del filamento. Essi sono formati attraverso progetti basati su mattonelle, dove un insieme discreto di fili parzialmente complementari si ibridano in una struttura ad anello con una discreta circonferenza. Questi anelli presentano estremità appiccicosa, consentendo la polimerizzazione efficace in filamenti alcuni micron di lunghezza e visualizzare simile cinetica di polimerizzazione come biopolimeri naturali. A causa della loro meccanica programmabile, questi tubi sono strumenti versatili, romanzo per studiare l’impatto di lp sulla singola molecola così come la scala di massa. In contrasto con i filamenti dell’actina, rimangono stabili nel corso di settimane, senza degenerazione notevole, e la loro gestione è relativamente semplice.

Introduction

A causa di comportamenti complessi abilitati di loro proprietà meccaniche uniche, polimeri semiflessibili sono elementi costitutivi fondamentali della materia vivente. In contrasto con polimeri flessibili, polimeri semiflessibili adottano una configurazione tesa a causa della loro rigidità di spina dorsale non vanishing pur rimanendo soggetti a forti fluttuazioni termiche1. Così, modelli puramente stocastici non possono applicarsi ai loro comportamenti, come con gli estremi di polimeri completamente flessibile o rigide. La cosiddetta catena di vite senza fine-come modello2,3,4 è stato sviluppato per quantificare questa rigidità tramite lp, che è la costante di decadimento della correlazione tangente-tangente lungo il filamento4. Se lp è paragonabile alla lunghezza del contorno (l.c) del filamento, il polimero è considerato semiflessibili1. Loro organizzazione in reti o fasci analoga ai poli di una tenda, si stabilizza l’intero sistema collettivo alle frazioni di volume basso, che conduce a viscoelastico insolite proprietà5,6,7, 8,9. Queste strutture forniscono alta elasticità al grande maglia dimensioni10, mantenendo l’integrità meccanica pur facilitando diffusivo e processi di trasporto attivo. Questa proprietà è particolarmente adatta per sistemi biologici come il citoscheletro o la matrice extracellulare, ma è anche ampiamente usato in alimento ingegneria1,11,12.

Andando oltre il loro significato per la materia vivente, è fondamentale esaminare completamente le proprietà fisiche di queste strutture al fine di avere gli strumenti per sviluppare materiali biomimetici o idrogel romanzo. In termini di polimeri semiflessibili, ciò implica la determinazione sistematica delle proprietà collettiva delle reti derivanti dalle proprietà del singolo filamento come lp e lo sviluppo di un quadro teorico descrittivo. In studi pionieristici, l’actina cellulare biopolimero nasce come sistema modello per polimeri semiflessibili e ancora ampiamente è considerato il gold standard5,13,14,15 , 16 , 17. Tuttavia, gli studi esaustivi sono limitati con questo sistema poiché vengono associati per le proprietà intrinseche di questa proteina. Vari approcci teorici hanno mirato a costruire una descrizione dei comportamenti meccanici non banale a livello di singolo-filamento e hanno portato a in particolare diverse stime scala per la dipendenza del modulo di taglio lineare elastico altopiano, G 0 (vale a dire, il “elasticità” della rete), per quanto riguarda la concentrazione (c) e lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mentre la scala di concentrazione è facilmente accessibile in esperimenti con l’actina-basato o altri sistemi di modello e previsioni teoriche sono state rigorosamente verificati13,16,24, 25, la scala per quanto riguarda lp è rimasta sperimentalmente inaccessibile. Questo, tuttavia, è una limitazione importante poiché lp è anche una variabile indipendente che è la definizione quantità di polimeri semiflessibili.

Questa centrale, naturale limitazione imposta dalla fissa lp di actina o altri polimeri derivati biologicamente come il collagene è stato recentemente risolto impiegando tubi di DNA basato su mattonelle, che sono sintonizzabili in loro proprietà meccaniche 9 , 26 , 27 , 28. lievi variazioni nelle architetture dei tubi (per esempio, diverso numero di costituenti del DNA strands all’interno dell’anello di unità) resa valori distinti per lp, che può essere valutato tramite microscopia a fluorescenza, analizzando un tubo fluttuante o valutando le configurazioni curve dei tubi aderiti diversi, come descritto in precedenza9,28. Queste analisi hanno rivelato che i valori dip ldelle popolazioni differenti del tubo variano nel corso di più di un ordine di grandezza e che le tecniche di valutazione differenti producono risultati coerenti9,28.

Sorprendentemente, il ridimensionamento complessivo del taglio lineare elastico altopiano modulo G0 per quanto riguarda la concentrazione e lp è stato segnalato per essere in contrasto con tutti i precedenti approcci teorici 9, in particolare dimostrando una molto più forte del previsto dipendenza lp. Questi risultati sottolineano il valore di un nuovo sistema di modello per studiare le proprietà centrale di polimeri semiflessibili. Che impiegano n-tubi di helix DNA drammaticamente amplia l’ambito di queste indagini. Non solo può lp essere variato liberamente senza cambiare il materiale di base, ma la natura intrinseca programmabile del DNA può attivare l’esame sistematico di elementi aggiuntivi, come le reticolazioni o processi cinetici di commutazione. Inoltre, questi tubi sono solubili in acqua e, a differenza della maggior parte delle proteine, stabile a pH adeguato e condizioni ioniche per diverse settimane, senza degrado rilevabili9.

Per assemblare questi tubi, viene utilizzato un insieme discreto di oligonucleotidi di DNA, ognuna delle quali contiene due domini che condividono sequenze di basi complementari ai due fili vicini (a causa di specifiche sequenze, un singolo filamento non può formare strutture quali i perni di capelli). Le sequenze complementari ibridano in modo ciclico, formando anelli chiusi, metà-sovrapposizione dei segmenti doppia elica n interconnessi (Figura 1A e B). Questi formano anelli presso un discreto diametro (Figura 1) e la loro configurazione metà sovrapposte espone assiale estremità appiccicosa complementari alle estremità appiccicose di un altro anello. Questa aggiunta selettiva di corrispondenti oligonucleotidi innesca un accatastamento degli anelli, che conduce la polimerizzazione efficace di filamentose tubi di elica di DNA di dimensione n (nHT). Loro lunghezze contorno in genere misurano alcuni micron di lunghezza, e la loro distribuzione di lunghezza è paragonabile a quella di actina filamenti9,26,27,28. È stato dimostrato per nanotubi di DNA simili che esibiscono infatti la cinetica di polimerizzazione simile a quelli dei microtubuli e i filamenti dell’actinaClasse p = “xrif” > 29. A seconda il numero n di singoli filamenti di DNA che compongono la struttura di anello di base, l’architettura nHT, nonché sua circonferenza e diametro, può essere variate controllably. Utilizzando più filamenti di DNA aumenta la circonferenza dei anelli/tubi, e il corrispondente cambiamento architettonico sposta le proprietà meccaniche a valori più elevati dip l(Figura 1), corrispondente a una maggiore rigidità. Sulla scala mesoscopica, questi valori dip lpiù grandi si traducono in meno piegati conformazioni grazie alla rigidità superiore (Figura 1 ed E).

Protocol

1. preparazione di n HTs Nota: qui, n indica il numero di diversi singoli filamenti di DNA coinvolti nella formazione dei tubi elica di una certa dimensione. Per n = 8, otto diversi singoli filamenti di DNA formano un anello di unità. Sequenze di DNA di acquisto (grado di purezza HPLC o superiore) da una sintesi di DNA adatta di servizio o eseguire sintesi di alta qualità e purificazione (sequenze esemplari riportati nella tabella 1).</…

Representative Results

L’Assemblea di nanotubi di DNA tramite una rampa di temperatura (Figura 2) è un metodo molto affidabile per formare questi polimeri semiflessibili artificiali. Questi polimeri hanno caratteristiche paragonabili alle loro controparti naturali, quali i filamenti dell’actina, ma forniscono un quadro sperimentale molto più ampio, poiché le loro proprietà meccaniche può essere controllably alterato9,27 </su…

Discussion

Per ottenere reti adeguatamente formate, assemblaggio i nanotubi di DNA è un passo cruciale. Errori durante il processo di sintesi influiscono negativamente sulla qualità di tubo; Pertanto, è consigliabile che HPLC o un processo più rigoroso essere usato per purificare i oligonucleotides. Poiché la formazione di discreti piuttosto che aggregati nanotubi di DNA, come pure la loro distribuzione di lunghezza, dipende la stechiometria equimolare dei oligonucleotides costituente n all’interno del set, è necessa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo che il finanziamento da DFG (1116/17-1) e la scuola di Lipsia di scienze naturali “BuildMoNa” (GSC 185). Questo lavoro è stato sostenuto attraverso il progetto di Fraunhofer Attract 601 683. T. H. riconosce finanziamenti del Fondo sociale europeo (FSE-100077106).

Materials

AFM cantilever ACTA AppNano
AFM – NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore – Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface
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