DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren
Summary
Semiflexible polymeren weer unieke mechanische eigenschappen die uitgebreid door levende systemen worden toegepast. Systematische studies over biopolymeren zijn echter beperkt omdat eigenschappen zoals polymeer rigiditeit niet toegankelijk zijn. Dit manuscript wordt beschreven hoe is deze beperking omzeild door programmeerbare DNA nanobuisjes, waardoor experimentele studies over de gevolgen van de stijfheid van de gloeidraad.
Abstract
Mechanische eigenschappen van complexe, polymeer gebaseerde zachte materie, zoals cellen of biopolymeer netwerken, kunnen worden begrepen in noch het Klassiek frame van flexibele polymeren noch van stijve staven. Onderliggende filamenten blijven uitgestrekte als gevolg van hun niet-verdwijnen ruggengraat stijfheid, die wordt gekwantificeerd via de persistentie lengte (l–p), maar ze zijn ook onderhevig aan sterke thermische schommelingen. Hun eindige Buigstijfheid leidt tot unieke, niet-triviale collectieve mechanica van bulk netwerken, waardoor de vorming van stabiele steigers op lage volumegehalten terwijl het verstrekken van grote maaswijdte. Dit onderliggende principe heerst in de natuur (bijvoorbeeld in cellen of weefsels), minimaliseren van de hoge moleculaire inhoud en teneinde diffusive of actief transport. Als gevolg van hun biologische gevolgen en mogelijke technologische toepassingen in biocompatibel hydrogels zijn semiflexible polymeren onderworpen aan aanzienlijke studie. Begrijpelijke onderzoek bleef echter uitdagende, omdat ze vertrouwden op natuurlijke polymeren, zoals de actine-filamenten, die niet vrij afstembare. Ondanks deze beperkingen en wegens het gebrek aan synthetische, mechanisch afstembare en semiflexible polymeren, werden door samensmelting van filamenten actine opgericht als het gemeenschappelijke modelsysteem. Een belangrijke beperking is dat de centrale hoeveelheid lp vrij kan niet worden afgestemd om te bestuderen van de impact ervan op macroscopische bulk structuren. Deze beperking werd opgelost door gebruik te maken van structureel programmeerbare DNA nanobuisjes, inschakelen van gecontroleerde wijziging van de stijfheid van de gloeidraad. Ze worden gevormd door tegel-gebaseerde ontwerpen, waar een discrete verzameling gedeeltelijk complementaire strengen te vermengen in de structuur van een ring met een discrete omtrek. Deze ringen beschikken over sticky ends, waardoor de effectieve polymerisatie in filamenten verschillende micron in lengte, en soortgelijke polymerisatie kinetiek berichtsymbool natuurlijke biopolymeren. Als gevolg van hun programmeerbare mechanica zijn deze buizen veelzijdig, nieuwe hulpmiddelen te bestuderen van de impact van lp op het single-molecuul, alsook de omvang van de bulk. In tegenstelling tot de actine-filamenten, ze blijven stabiel in weken, zonder opvallende degeneratie, en hun behandeling is relatief eenvoudig.
Introduction
Als gevolg van de complexe gedrag ingeschakeld door hun unieke mechanische eigenschappen, zijn semiflexible polymeren fundamentele bouwstenen van de levende materie. In tegenstelling tot flexibele polymeren vast semiflexible polymeren een uitgestrekte configuratie als gevolg van hun niet-verdwijnen ruggengraat stijfheid terwijl nog onderworpen aan sterke schommelingen van de thermische1. Dus worden niet puur stochastische modellen om hun gedrag, net als bij de uitersten van volledig flexibele of stijve polymeren toegepast. De zogenaamde worm-achtige keten model2,3,4 werd ontwikkeld om te kwantificeren deze stijfheid via de lp, dat is de constante verval van de correlatie van de tangens-tangens langs de gloeidraad4. Als lp vergelijkbaar met de contour lengte (lc) van de gloeidraad is, wordt het polymeer beschouwd als semiflexible1. Analoog aan de Polen van een tent, hun regelingen in netwerken of bundels stabiliseert het gehele collectieve systeem op laag volume breuken, wat leidt tot ongewone visco eigenschappen5,6,7, 8,9. Deze structuren bieden hoge elasticiteit van de grote mesh maten10, behoud van mechanische integriteit terwijl nog diffusive vergemakkelijken en actief transportprocessen. Deze eigenschap is vooral geschikt voor biologische systemen zoals het cytoskelet of de extracellulaire matrix, maar het wordt ook op grote schaal gebruikt in voedsel engineering1,11,12.
Die verder gaan dan hun betekenis aan levende materie, is het cruciaal voor de fysische eigenschappen van deze structuren uitvoerig te onderzoeken om de tools te ontwikkelen biomimetische materialen of Roman hydrogels. Dit betekent in termen van semiflexible polymeren, de systematische bepaling van de collectieve eigenschappen van netwerken als gevolg van single-filament eigenschappen zoals lp en de ontwikkeling van een beschrijvende theoretisch kader. Aantal baanbrekende studies, de cellulaire biopolymeer actine werd opgericht als een modelsysteem voor semiflexible polymeren en wordt nog steeds beschouwd als de gouden standaard5,13,14,15 , 16 , 17. uitvoerige studies zijn echter beperkt met dit systeem omdat ze zijn gebonden aan de inherente eigenschappen van dit eiwit. Verschillende theoretische benaderingen hebben gericht op het opbouwen van een beschrijving van de niet-triviale mechanische problemen op het niveau van de single-filament en hebben geleid tot met name verschillende schalen voorspellingen voor de afhankelijkheid van de lineaire elastische plateau afschuifmodulus, G 0 (dat wil zeggen, de “elasticiteit” van het netwerk), met betrekking tot concentratie (c) en lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Terwijl de concentratie schaal gemakkelijk toegankelijk in experimenten met actine gebaseerde of andere modelsystemen is en terwijl theoretische voorspellingen strikt zijn gecontroleerd13,16,24, 25, de schaal met betrekking tot lp experimenteel ontoegankelijk gebleven. Dit is echter een grote beperking omdat lp is ook een onafhankelijke variabele thats de definiërende hoeveelheid semiflexible polymeren.
Deze centrale, natuurlijke beperking opgelegd door de vaste lp van actine of andere biologisch-afgeleid polymeren zoals collageen is onlangs opgelost door gebruik te maken van dakpan DNA buizen, die afstembare in hun mechanische eigenschappen 9 , 26 , 27 , 28. lichte variaties in de platforms van de buizen (bijvoorbeeld verschillende aantallen samenstellende DNA strengen binnen de ring van de eenheid) opbrengst verschillende waarden voor lp, die kan worden geëvalueerd via fluorescentie microscopie, door het analyseren van een schommelende buis of door de beoordeling van de gebogen configuraties van verschillende zelfklevend buizen, als eerder beschreven9,28. Deze analyses bleek dat de lp -waarden van de verschillende buis-bevolking over meer dan één orde van grootte variëren en dat verschillende evaluatietechnieken consistente resultaten9,28opleveren.
Verrassend, is de totale schaal van de lineaire elastische plateau schuintrekken modulus G0 ten opzichte van de concentratie en de lp gemeld als onverenigbaar is met alle eerdere theoretische benaderingen 9, in het bijzonder aan te tonen een veel sterker dan voorspelde afhankelijkheid van lp. Deze bevindingen onderstrepen de waarde van een nieuw modelsysteem voor het bestuderen van de centrale eigenschappen van semiflexible polymeren. Met n-helix DNA buizen dramatisch verbreedt het toepassingsgebied van deze onderzoeken. Niet alleen kan lp vrij worden gevarieerd zonder dat het basismateriaal, maar de inherente programmeerbare aard van DNA een systematisch onderzoek van aanvullende elementen, zoals crosslinks of kinetische switch processen kunt inschakelen. Bovendien, deze buizen zijn oplosbaar in water en, in tegenstelling tot de meeste proteïnen, stabiel in voldoende pH en Ionische voorwaarden voor enkele weken, zonder aantasting van de detecteerbare9.
Te monteren deze buizen, een discrete verzameling van DNA oligonucleotides wordt gebruikt, die elk twee domeinen die delen van de complementaire base sequenties aan twee naburige strengen bevat (als gevolg van de specifieke opeenvolgingen, een enkele streng kan zich geen vormen structuren zoals haar pinnen). De complementaire sequenties te vermengen in een cyclische manier, vorming van gesloten, half-overlappende ringen van n onderling verbonden dubbel-spiraalvormige segmenten (figuur 1A en B). Deze ringen vormen op een discrete diameter (Figuur 1 c), en hun half-overlappende configuratie blootstelt axiale sticky ends complementair aan de kleverige uiteinden van een andere ring. Deze selectieve toevoeging van matching oligonucleotides triggert een stapeling van de ringen, wat leidt tot de effectieve polymerisatie van draadvormige DNA helix buizen van grootte n (nHT). Hun contour lengtes meten meestal verschillende micron in lengte, en de distributie van hun lengte is vergelijkbaar met dat van actine filamenten9,26,27,28. Voor soortgelijke DNA nanotubes is aangetoond dat zij inderdaad polymerisatie kinetiek vergelijkbaar met die van de actine-filamenten en microtubuli vertonenp klasse = “xref” > 29. Afhankelijk van het getal n van individuele DNA-strengen die deel uitmaken van de basis ring-structuur, kunnen de nHT-architectuur, evenals de omtrek en de diameter, controllably worden gevarieerd. Het gebruik van meer DNA-strengen verhoogt de omtrek van de ringen/buizen en de bijbehorende architecturale verandering verschuift de mechanische eigenschappen aan hogere lp -waarden (Figuur 1 c), die overeenkomt met een hogere stijfheid. Op de mesoscopische schaal, deze grotere lp -waarden worden omgezet in minder gebogen conformaties als gevolg van de hogere stijfheid (Figuur 1 d en E).
Protocol
Representative Results
Discussion
Met het oog op een goed gevormde netwerken, is monteren van de DNA-nanobuisjes een cruciale stap. Fouten tijdens het proces van synthese negatief effect hebben op de kwaliteit van de buis; Daarom is het aanbevolen dat HPLC of een strengere proces worden gebruikt voor het zuiveren van de oligonucleotides. Aangezien de vorming van discrete in plaats van geaggregeerde DNA nanobuisjes, evenals hun lengte distributie, hangt af van het mengsel stoichiometrie van de samenstellende oligonucleotides van n binnen de set, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen dat financiering door DFG (1116/17-1) en de Leipzig School of Natural Sciences “BuildMoNa” (SGR 185). Dit werk is ondersteund door het Fraunhofer aantrekken project 601 683. T. H. erkent financiering uit het Europees Sociaal Fonds (ESF-100077106).
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
References
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
