डीएनए Semiflexible पॉलिमर का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में नैनोट्यूब
Summary
Semiflexible पॉलिमर अद्वितीय यांत्रिक गुण है कि बड़े पैमाने पर रहने वाले सिस्टम द्वारा लागू कर रहे हैं प्रदर्शित करते हैं । हालांकि, इस तरह बहुलक कठोरता के रूप में गुणों से दुर्गम है के बाद से, पर व्यवस्थित अध्ययन । इस पांडुलिपि का वर्णन कैसे इस सीमा प्रोग्राम डीएनए नैनोट्यूब द्वारा दरकिनार है, रेशा कठोरता के प्रभाव पर प्रयोगात्मक अध्ययन को सक्षम करने ।
Abstract
जटिल के यांत्रिक गुणों, बहुलक आधारित नरम बात है, ऐसे कोशिकाओं या गैर बहुलक नेटवर्क के रूप में, न तो लचीला पॉलिमर के शास्त्रीय फ्रेम और न ही कठोर छड़ के में समझा जा सकता है । अंतर्निहित रेशा उनके गैर लुप्त रीढ़ की जकड़न, जो हठ लंबाई (एलपी) के माध्यम से मात्रा है, लेकिन वे भी मजबूत थर्मल उतार चढ़ाव के अधीन हैं के कारण फैला हुआ रहते हैं । उनके परिमित झुकने कठोरता थोक नेटवर्क के अद्वितीय, गैर तुच्छ सामूहिक यांत्रिकी की ओर जाता है, कम मात्रा भागों में स्थिर पाड़ों के गठन को सक्षम करने, जबकि बड़े मेष आकार प्रदान करते हैं । इस अंतर्निहित सिद्धांत प्रकृति में प्रचलित है (जैसे, कोशिकाओं या ऊतकों में), उच्च आणविक सामग्री को कम करने और इस तरह प्रसार या सक्रिय परिवहन की सुविधा. उनके जैविक निहितार्थ और जैव संगत hydrogels में संभावित तकनीकी अनुप्रयोगों के कारण, semiflexible पॉलिमर काफी अध्ययन के अधीन किया गया है । हालांकि, सुबोध की जांच चुनौतीपूर्ण बनी रही क्योंकि वे प्राकृतिक पॉलिमर पर भरोसा करते हैं, जैसे actin रेशा, जो स्वतंत्र रूप से स्वरित्र नहीं हैं । इन सीमाओं के बावजूद और सिंथेटिक, यांत्रिक स्वरित्र, और semiflexible पॉलिमर की कमी के कारण, actin रेशा आम मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया था । एक प्रमुख सीमा है कि केंद्रीय मात्रा एलपी स्वतंत्र रूप से macroscopic थोक संरचनाओं पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए देखते नहीं किया जा सकता है । इस सीमा संरचनात्मक रूप से प्रोग्राम डीएनए नैनोट्यूब को रोजगार, रेशा कठोरता के नियंत्रित परिवर्तन को सक्षम करने से हल किया गया था । वे टाइल आधारित डिजाइन, जहां आंशिक रूप से पूरक किस्में के एक असतत सेट एक असतत परिधि के साथ एक अंगूठी संरचना में संकरण के माध्यम से गठित कर रहे हैं । ये छल्ले सुविधा चिपचिपा समाप्त होता है, लंबाई में कई माइक्रोन रेशा में प्रभावी बहुलकीकरण को सक्षम करने, और प्राकृतिक के रूप में बहुलकीकरण कैनेटीक्स समान पॉलिमर प्रदर्शन । उनके प्रोग्राम यांत्रिकी के कारण, इन ट्यूबों बहुमुखी हैं, उपंयास उपकरण एकल अणु पर एलपी के प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से थोक पैमाने पर अध्ययन करने के लिए । actin रेशा के विपरीत, वे सप्ताह से अधिक स्थिर रहते हैं, उल्लेखनीय अध कि बिना, और उनके हैंडलिंग तुलना सीधी है ।
Introduction
जटिल उनके अद्वितीय यांत्रिक गुणों द्वारा सक्षम व्यवहार के कारण, semiflexible पॉलिमर बुनियादी रहते मामले के निर्माण ब्लॉकों रहे हैं । लचीला पॉलिमर के विपरीत, semiflexible पॉलिमर एक फैलाया विंयास उनके गैर लुप्त रीढ़ की जकड़न के कारण को अपनाने, जबकि अभी भी मजबूत थर्मल उतार चढ़ाव के अधीन शेष1। इस प्रकार, विशुद्ध रूप से stochastic मॉडल अपने व्यवहार के लिए लागू नहीं किया जा सकता है, के रूप में पूरी तरह से लचीला या कठोर पॉलिमर के चरम के साथ । तथाकथित कीड़ा की तरह चेन मॉडल2,3,4 एलपी, जो रेशा4के साथ स्पर्श-स्पर्श सहसंबंध का क्षय निरंतर है के माध्यम से इस कठोरता को बढ़ाता था । एलपी रेशा के समोच्च लंबाई (एलसी) के लिए तुलनीय है, तो बहुलक semiflexible1माना जाता है । एक तंबू के डंडे के अनुरूप, नेटवर्क या बंडलों में उनकी व्यवस्था कम मात्रा भागों में पूरे सामूहिक प्रणाली स्थिर, असामांय viscoelastic गुण के लिए अग्रणी5,6,7, 8,9. इन संरचनाओं बड़े जाल पर उच्च लोच प्रदान10आकार, यांत्रिक अखंडता को बनाए रखने जबकि अभी भी प्रसार और सक्रिय परिवहन प्रक्रियाओं की सुविधा. यह गुण cytoskeleton या extracellular मैट्रिक्स जैसे जैविक प्रणालियों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, लेकिन यह भी व्यापक रूप से खाद्य अभियांत्रिकी1,11,12में प्रयोग किया जाता है ।
उनके महत्व से परे रहने वाले मामले में जा रहे हैं, यह व्यापक इन संरचनाओं के भौतिक गुणों की जांच के लिए उपकरण के लिए biomimetic सामग्री या उपंयास hydrogels विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । semiflexible पॉलिमर के संदर्भ में, इस तरह के एलपी और एक वर्णनात्मक सैद्धांतिक ढांचे के विकास के रूप में एकल रेशा गुणों से उत्पन्न नेटवर्क के सामूहिक गुणों के व्यवस्थित निर्धारण का तात्पर्य है । अग्रणी अध्ययन में, सेलुलर, बहुलक actin semiflexible पॉलिमर के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया था और अभी भी व्यापक रूप से माना जाता है सोने के मानक5,13,14,15 , 16 , 17. हालांकि, संपूर्ण अध्ययन इस प्रणाली के साथ सीमित है क्योंकि वे इस प्रोटीन के निहित गुणों के लिए बाध्य कर रहे हैं । विभिंन सैद्धांतिक दृष्टिकोण गैर तुच्छ यांत्रिक व्यवहार के एकल रेशा स्तर पर एक विवरण के निर्माण के उद्देश्य से है और विशेष रूप से अलग रैखिक लोचदार पठार कतरनी मापांक, जी की निर्भरता के लिए पूर्वानुमान स्केलिंग के लिए नेतृत्व किया है 0 (यानी, नेटवर्क की “लोच”), एकाग्रता के संबंध में (ग) और एलपी6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. जबकि एकाग्रता स्केलिंग actin-आधारित या अन्य मॉडल प्रणालियों के साथ प्रयोगों में आसानी से सुलभ है और सैद्धांतिक भविष्यवाणियों कड़ाई से सत्यापित किया गया है13,16,24, 25, lp के संबंध में स्केलिंग का प्रयोग दुर्गम बना हुआ है । यह, तथापि, के बाद से एक प्रमुख सीमा है पी भी एक स्वतंत्र चर है कि semiflexible पॉलिमर की मात्रा को परिभाषित है ।
यह केंद्रीय, प्राकृतिक actin के फिक्स्ड एलपी या अंय जैविक रूप से प्राप्त पॉलिमर जैसे कोलेजन के द्वारा लगाया हाल ही में टाइल-आधारित डीएनए ट्यूबों को रोजगार, जो उनके यांत्रिक गुणों में स्वरित्र है द्वारा हल किया गया है 9 , 26 , 27 , 28. ट्यूबों के आर्किटेक्चर में मामूली बदलाव (उदाहरण के लिए, इकाई की अंगूठी के भीतर घटक डीएनए किस्में के विभिंन नंबरों) एलपी, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है के लिए अलग मूल्यों उपज, या तो एक उतार-चढ़ाव ट्यूब का विश्लेषण करके या कई का पालन ट्यूबों के घुमावदार विंयास का मूल्यांकन करके, जैसा कि पहले9,28वर्णित है । इन विश्लेषणों से पता चला कि एलपी मूल्यों के विभिंन ट्यूब आबादी के परिमाण के एक से अधिक आदेश पर भिंन है और है कि विभिंन मूल्यांकन तकनीक अनुरूप परिणाम9,28उपज ।
आश्चर्य की बात है, रैखिक लोचदार पठार कतरनी मापांक जी0 एकाग्रता और एलपी के संबंध में के समग्र स्केलिंग सभी पिछले सैद्धांतिक दृष्टिकोण के साथ असंगत होने की सूचना दी गई है 9, विशेष रूप से एक बहुत मजबूत प्रदर्शन से एलपीपर निर्भरता की भविष्यवाणी की । इन निष्कर्षों को semiflexible पॉलिमर के केंद्रीय गुणों का अध्ययन करने के लिए एक नए मॉडल प्रणाली के मूल्य पर जोर दिया । n-कुण्डल डीएनए ट्यूब रोजगार नाटकीय रूप से इन जांचों के दायरे व्यापक । न केवल एलपी बुनियादी सामग्री को बदलने के बिना स्वतंत्र रूप से विविध सकता है, लेकिन डीएनए के निहित प्रोग्राम प्रकृति crosslinks या काइनेटिक स्विचन प्रक्रियाओं के रूप में अतिरिक्त तत्वों, के व्यवस्थित परीक्षा सक्षम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, इन ट्यूबों पानी में घुलनशील है और, सबसे अधिक प्रोटीन के विपरीत में, कई हफ्तों के लिए पर्याप्त पीएच और ईओण की शर्तों में स्थिर, बिना पता लगाने योग्य गिरावट9।
इन ट्यूबों को इकट्ठा करने के लिए, डीएनए oligonucleotides का एक असतत सेट का उपयोग किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक दो डोमेन है कि शेयर पूरक आधार अनुक्रम दो पड़ोसी किस्में (विशिष्ट दृश्यों के कारण, एक भी किनारा संरचनाओं जैसे हेयर पिन के रूप में नहीं कर सकते हैं) शामिल हैं । पूरक अनुक्रम एक चक्रीय तरीके में संकरण, संलग्न बनाने, n परस्पर डबल पेचदार क्षेत्रों (आंकड़ा 1a और बी) के आधा अतिव्यापी छल्ले । ये छल्ले एक असतत व्यास पर फार्म (चित्रा 1C), और उनके आधे अतिव्यापी विंयास उजागर अक्षीय चिपचिपा एक और अंगूठी के चिपचिपा छोर के पूरक समाप्त होता है । मिलान oligonucleotides के इस चयनात्मक इसके अलावा छल्ले के stacking ट्रिगर, आकार n (nएचटी) के रेशा डीएनए कुंडलित ट्यूबों के प्रभावी बहुलकीकरण के लिए अग्रणी । उनके समोच्च लंबाई आम तौर पर लंबाई में कई माइक्रोन उपाय है, और उनकी लंबाई वितरण actin रेशा के लिए तुलनीय है9,26,27,28. यह इसी तरह के डीएनए नैनोट्यूब के लिए दिखाया गया है कि वे वास्तव में actin रेशा और microtubules के उन लोगों के समान बहुलकीकरण कैनेटीक्स प्रदर्शनp class = “xref” > 29. व्यक्तिगत डीएनए की संख्या n के आधार पर बुनियादी अंगूठी संरचना बनाने किस्में, एनएचटी वास्तुकला, साथ ही इसकी परिधि और व्यास, नियंत्रित किया जा सकता है विविध । अधिक डीएनए किस्में के छल्ले की परिधि बढ़ जाती है का उपयोग करना/, और इसी वास्तु परिवर्तन उच्च एलपी मूल्यों (चित्रा 1C), एक उच्च कठोरता के लिए इसी यांत्रिक गुणों बदलाव । mesoscopic स्केल पर, ये बड़ा एलपी मान उच्च कठोरता ( चित्रा 1 डी और ई) के कारण कम तुला अनुरूपता में अनुवाद ।
Protocol
1. तैयारी n HTs
नोट: यहां, n अलग एकल डीएनए एक निश्चित आकार का कुंडलित ट्यूबों के गठन में शामिल किस्में की संख्या का अर्थ है । के लिए n = 8, आठ अलग एकल डीएनए किस्में एक इकाई की अंगूठी बनाते…
Representative Results
Discussion
ठीक से गठित नेटवर्क प्राप्त करने के लिए, डीएनए नैनोट्यूब कोडांतरण एक महत्वपूर्ण कदम है । संश्लेषण प्रक्रिया के दौरान त्रुटियाँ नकारात्मक ट्यूब गुणवत्ता प्रभाव; इसलिए, यह अनुशंसित है कि HPLC या oligonucleotides को ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम DFG द्वारा धन स्वीकार (1116/17-1) और प्राकृतिक विज्ञान के लिपजिग स्कूल “BuildMoNa” (GSC १८५) । इस काम Fraunhofer आकर्षित परियोजना ६०१ ६८३ के माध्यम से समर्थन किया गया है । टी. एच. यूरोपीय सामाजिक कोष (ESF-१०००७७१०६) से धन स्वीकार करता है ।
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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