JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

DNA nanorør som et allsidig verktøy for å studere Semiflexible polymerer

Published: October 25, 2017
doi:
10.3791/56056
, , , , , , , ,
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I,Universität Leipzig

Summary

Semiflexible polymerer vise unike mekaniske egenskaper som brukes mye av leve systemer. Systematiske studier på biopolymers er imidlertid begrenset siden egenskaper som polymer stivhet er utilgjengelig. Denne oppgaven beskriver hvordan denne begrensningen er circumvented ved programmerbare DNA nanorør, aktivere eksperimentelle studier av effekten av filament stivhet.

Abstract

Mekaniske egenskaper i komplekse, polymer-baserte myk saken, for eksempel celler eller Research nettverk, kan forstås i verken klassiske rammen av fleksible polymerer eller av stive stenger. Underliggende filamenter forblir utstrakt på grunn av deres ikke-forsvinnende ryggraden stivhet, som er kvantifisert via utholdenhet lengden (lp), men de er også sterke termisk store. Deres endelig bøying stivhet fører til unike og ikke-triviell kollektive mekanikken i bulk nettverk, slik at dannelsen av stabil stillaser på lavt volum fraksjoner samtidig som stor maske størrelsene. Dette underliggende prinsippet er utbredt i naturen (f.eks i celler og vev) minimere høy molekylær innholdet og dermed tilrettelegge diffusive eller aktiv transport. Deres biologiske virkningene og teknologiske bruksmuligheter i biokompatible hydrogels, har semiflexible polymerer vært gjenstand for betydelig studier. Imidlertid forble forståelig undersøkelser utfordrende siden de stolte på naturlige polymerer, som begrepsordbok filamenter, som ikke er fritt tunable. Til tross for disse begrensningene og mangel på syntetisk, mekanisk tunable og semiflexible polymerer, ble begrepsordbok filamenter etablert som den vanlige modellen. En stor begrensning er at sentrale antallet lp ikke kan stilles fritt for å studere virkningen på makroskopisk bulk strukturer. Denne begrensningen ble løst ved hjelp av strukturelt programmerbare DNA nanorør, aktivere kontrollert endring av filament stivhet. De er dannet gjennom filbasert design, der et atskilt sett med delvis komplementære tråder hybridize i en ring struktur med en diskret. Disse ringene funksjonen Trege ender, muliggjør effektiv polymerisasjon i filamenter flere mikrometer i lengde, og vise lignende polymerisasjon kinetics som naturlig biopolymers. På grunn av deres programmerbare mekanikere er disse rørene svært allsidig, romanen verktøy for å studere virkningen av lp på enkelt-molekylet samt bulk skalaen. I motsetning til utgangen filamenter, de forblir stabil over uker, uten nevneverdige degenerasjon, og deres er relativt enkel.

Introduction

På grunn av de komplekse atferd aktivert etter unike mekaniske egenskaper, er semiflexible polymerer grunnleggende byggeklossene i levende materie. I motsetning til fleksible polymerer vedta semiflexible polymerer en utstrakt konfigurasjon på grunn av deres ikke-forsvinnende ryggraden stivhet og fortsatt underlagt sterk termiske fluktuasjoner1. Dermed kan ikke rent stokastiske modeller brukes på deres atferd, som med ekstreme fullt fleksible eller rigide polymerer. Såkalte ormen som kjeden modell2,3,4 ble utviklet for å kvantifisere dette stivhet via lp, som er decay konstant tangent-tangens korrelasjon langs filament4. Hvis lp kan sammenlignes med omkrets (lc) av filament, regnes polymer semiflexible1. Analoge til polakkene i et telt, deres arrangementer i nettverk eller bunter stabiliserer hele kollektive systemet på lavt volum fraksjoner, fører til uvanlig viskoelastiske egenskaper5,6,7, 8,9. Disse strukturene gir høy elastisiteter store mesh størrelser10, opprettholde mekanisk integritet mens fortsatt tilrettelegging diffusive og aktiv transport prosesser. Denne egenskapen er spesielt egnet for biologiske systemer som cytoskeleton eller ekstracellulær matrix, men det er også mye brukt i mat ingeniør1,11,12.

Går utover deres betydning til levende materie, er det avgjørende omfattende undersøke de fysiske egenskapene til disse strukturene for å få verktøy for å utvikle biomimetic materialer eller roman hydrogels. I semiflexible polymerer innebærer dette systematisk fastsettelse av kollektive egenskapene til nettverk som følge av enkelt-filament egenskaper som lp og utviklingen av en beskrivende teoretisk ramme. I banebrytende studier, mobilnettet Research begrepsordbok ble etablert som et modellsystem for semiflexible polymerer og regnes fortsatt mye gull standard5,13,14,15 , 16 , 17. men omfattende studier er begrenset med dette systemet siden de er bundet til de iboende egenskapene av dette proteinet. Ulike teoretiske tilnærminger har å bygge en beskrivelse av ikke-triviell mekanisk på enkelt-filament nivå og har ført til spesielt forskjellige skalering spådommer for avhengigheten av lineære elastiske platå skjær modulus, G 0 (dvs. “elastisitet” av nettverket) med hensyn til konsentrasjon (c) og lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mens konsentrasjon skaleringen er lett tilgjengelig i eksperimenter med utgangen-basert eller andre modellsystemer og mens teoretisk spådommer er blitt bekreftet13,16,24, 25, skaleringen med hensyn til lp har vært eksperimentelt utilgjengelig. Dette er imidlertid en stor begrensning siden lp er også en uavhengig variabel som definere antall semiflexible polymerer.

Dette sentrale, naturlige begrensning pålagt av fast lp av utgangen eller andre biologisk-baserte polymerer som kollagen har nylig blitt løst ved å bruke filbasert DNA rør, som er tunable i sine mekaniske egenskaper 9 , 26 , 27 , 28. små variasjoner i arkitekturene av rør (f.eks forskjellig antall deltagende DNA tråder i enhet ringen) gir distinkte verdier for lp, som kan evalueres via fluorescens mikroskopi, enten ved å analysere en varierende tube eller ved å evaluere buet konfigurasjoner av flere adhered rør, som beskrevet tidligere9,28. Disse analysene viste at lp -verdier mellom de ulike tube varierer over flere størrelsesorden og at ulike evaluering gir konsistente resultater9,28.

Overraskende, er den totale skaleringen av lineære elastiske platå skjær modulus G0 med hensyn til konsentrasjon og lp rapportert å være uforenlig med alle tidligere teoretiske tilnærminger 9, spesielt demonstrere en mye sterkere enn anslått avhengighet av lp. Disse funnene vektlegger verdien av en ny modellsystem å studere sentrale egenskapene til semiflexible polymerer. Ansette n-helix DNA rør dramatisk utvider omfanget av disse undersøkelsene. Ikke bare kan lp fritt variert uten å endre det grunnleggende materialet, men iboende programmerbare natur DNA kan aktivere systematisk undersøkelse av flere elementer som krysskoblinger eller kinetisk bytte prosesser. I tillegg disse rørene er løselig i vann, og i motsetning til de fleste proteiner, stabil i tilstrekkelig pH og ioniske forhold i flere uker, uten synlig fornedrelse9.

Å sette sammen disse rør, et atskilt sett med DNA oligonucleotides brukes, hver inneholder to domener deler komplementære base sekvenser til to nabokommunene tråder (på grunn av de spesifikke sekvensene, en enkelt tråd kan ikke danne strukturer som hårnåler). Sekvenser komplementære hybridize i en syklisk måte, danner innesluttet, halv-overlappende ringer n sammen dobbel-spiralformede segmenter (figur 1A og B). Disse ringene skjemaet på en diskret diameter (figur 1 c) og deres halv-overlappende konfigurasjon viser aksial klissete ender komplementær til en annen ring klissete ender. Dette selektiv tillegg med matchende oligonucleotides utløser en stabling ringer, fører til effektiv polymerisasjon av trådformede DNA helix rør størrelse n (nHT). Deres kontur lengder måle vanligvis flere mikrometer i lengde, og lengde distribusjonen er sammenlignes med begrepsordbok, filamenter,9,,26,,27,,28. Det har vært vist for lignende DNA nanorør at de faktisk viser polymerisasjon kinetics ligner begrepsordbok filamenter og piskehale som hengerp class = “xref” > 29. Avhengig av mange n av personlige DNA tilnærmingene som utgjør den grunnleggende ring strukturen, kan nHT arkitektur, samt sine omkrets og diameter, controllably endres. Mer DNA tilnærmingene øker omkretsen av ringer/rør, og tilsvarende arkitektoniske endringen Skift de mekaniske egenskapene til høyere lp verdier (figur 1 c), tilsvarer en høyere stivhet. På Mesoskopisk skala, oversette disse større lp verdiene til mindre bøyd konformasjonen på grunn av høyere stivhet (figur 1 d og E).

Protocol

1. forberedelse n HTs Merk: her, n angir antall ulike enkelt DNA tilnærmingene involvert i dannelsen av Spiralen rørene av en viss størrelse. N = 8, åtte ulike enkelt DNA tilnærmingene utgjør en enhet ring. Kjøp DNA-sekvenser (HPLC renhet klasse eller høyere) fra en egnet DNA-syntese tjeneste eller utføre høykvalitets syntese og rensing (et eksemplarisk sekvenser er gitt i tabell 1). Resuspend lyofiliserte oligonucleot…

Representative Results

Montering av DNA nanorør via en temperatur rampe (figur 2) er en svært pålitelig metode til disse kunstig semiflexible polymerer. Disse polymerer har sammenlignbare egenskaper for motpartene naturlig forekommende, som begrepsordbok filamenter, men gir et mye bredere eksperimentelle rammeverk siden sine mekaniske egenskaper kan være controllably endret9,27 . Som biopolymers, de kan arrangeres i net…

Discussion

For å få riktig formet nettverk, er montering DNA nanorør et viktig skritt. Feil under synteseprosessen innvirkning negativ rør kvalitet; Det anbefales derfor at HPLC eller en strengere prosessen brukes til å rense oligonucleotides. Siden dannelsen av diskret enn akkumulert DNA nanorør, samt lengden distribusjonen, avhenger av den ekvimolare støkiometri av n konstituerende oligonucleotides innenfor settet, er det nødvendig å remeasure konsentrasjonen av innkjøpte tråder, siden gitt verdiene kan varier…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi erkjenner finansiering av DFG (1116/17-1) og Leipzig School of Natural Sciences “BuildMoNa” (GSC 185). Dette arbeidet har vært støttet gjennom Fraunhofer tiltrekke prosjektet 601 683. T. H. erkjenner finansiering fra European Social Fund (ESF-100077106).

Materials

AFM cantilever ACTA AppNano
AFM – NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore – Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

DNA NanotubesSemiflexible PolymersSoft MatterBiopolymersFilamentsNetworksHydrogelsCell MigrationStiffnessRheologyDNA HybridizationDNA StrandsThermocyclerSample PreparationDynamic Shear RheometerSample LoadingEvaporation Prevention

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image