JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

DNA nanorör som ett mångsidigt verktyg för att studera Semiflexible polymerer

Published: October 25, 2017
doi:
10.3791/56056
, , , , , , , ,
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I,Universität Leipzig

Summary

Semiflexible polymerer visar unika mekaniska egenskaper som tillämpas i stor utsträckning av living systems. Systematiska studier av biopolymerer är dock begränsad eftersom egenskaper såsom polymer styvhet är oåtkomliga. Detta manuskript beskriver hur denna begränsning är kringgås av programmerbara DNA nanorör, aktivera experimentella studier om effekterna av glödtrådens styvhet.

Abstract

Mekaniska egenskaper hos komplexa, polymerbaserade mjuka material, till exempel celler eller biopolymer nätverk, kan förstås i varken klassisk ram av flexibla polymerer nor av styva spön. Underliggande filament förblir utsträckta på grund av deras icke-vanishing ryggraden stelhet, som kvantifieras via persistens längden (lp), men de är också föremål för stark termiska variationer. Deras ändliga böjstyvheten leder till unika, icke-trivial kollektiva mekanik av bulk nätverk, gör det möjligt för bildandet av stabila ställningar på låg volymfraktioner samtidigt som den ger stor maskstorlek. Denna underliggande princip är förhärskande i naturen (t.ex. i celler eller vävnader), minimera hög molekylära innehåll och därigenom underlätta diffus eller aktiv transport. På grund av deras biologiska konsekvenser och möjliga tekniska tillämpningar i biokompatibla hydrogels, har semiflexible polymerer varit föremål för betydande studie. Men förblev begriplig utredningar utmanande eftersom de förlitade sig på naturliga polymerer, såsom aktin filament, som inte är fritt avstämbara. Trots dessa begränsningar och på grund av syntetiska, mekaniskt avstämbara och semiflexible polymerer fastställdes aktin filament som det gemensamma modell-systemet. En stor begränsning är att den centrala kvantitet lp fritt inte kan stämmas för att studera dess inverkan på makroskopiska bulk strukturer. Denna begränsning har lösts genom att anställa strukturellt programmerbara DNA nanorör, aktivera kontrollerade ändring av glödtrådens styvheten. De bildas genom kakel-baserade mönster, där en diskret mängd av delvis kompletterande programområden hybridisera i en ringstruktur med en diskret omkrets. Dessa ringar har klibbiga ändar, möjliggör effektiv polymerisation i filament flera mikrometer i längd, och Visa liknande polymerisation kinetik som naturliga biopolymerer. På grund av deras programmerbara mekanik är dessa rör mångsidig, roman verktyg att studera effekterna av lp på singel-molekylen som bulk skalan. I motsats till aktin filament, de förbli stabila under veckorna, utan anmärkningsvärda degeneration, och deras hantering är comparably okomplicerat.

Introduction

På grund av de komplexa beteenden aktiveras med deras unika mekaniska egenskaper, är semiflexible polymerer de grundläggande byggstenarna i levande materia. I motsats till flexibla polymerer anta semiflexible polymerer en utsträckta konfigurationen på grund av deras icke-vanishing ryggraden stelhet medan fortfarande är föremål för starka termisk växlingar1. Således inte kan rent stokastiska modeller tillämpas på deras beteenden, som med ytterligheterna av fullt flexibel eller styv polymerer. Så kallade maskliknande kedja modell2,3,4 utvecklades för att kvantifiera denna stelhet via lp, vilket är konstanten förfall av tangens-tangens korrelationen längs den glödtråd4. Om lp är jämförbar med contour längden (lc) glödtrådens, betraktas polymeren semiflexible1. Analogt med polerna av ett tält, sina arrangemang i nätverk eller buntar stabiliserar hela kollektiva systemet på låg volymfraktioner, leder till ovanliga viskoelastiska egenskaper5,6,7, 8,9. Dessa strukturer ger hög elasticiteter på stora mesh storlekar10, att upprätthålla mekanisk integritet samtidigt underlätta diffus och aktiv transportprocesser. Detta boende är speciellt lämplig för biologiska system såsom cytoskelettet eller extracellulärmatrix, men det är också allmänt används i livsmedel engineering1,11,12.

Utöver deras betydelse till levande materia, är det viktigt att utförligt undersöka de fysikaliska egenskaperna hos dessa strukturer för att ha verktyg för att utveckla biomimetiska material eller romanen hydrogels. När det gäller semiflexible polymerer innebär detta systematiska bestämningen av kollektiva egenskaper för nätverk som härrör från singel-glödtråden egenskaper såsom lp och utvecklingen av en beskrivande teoretiska ram. I pionjärstudier, cellulära biopolymer actin etablerades som ett modellsystem för semiflexible polymerer och anses fortfarande allmänt vara den gyllene standard5,13,14,15 , 16 , 17. dock uttömmande studier är begränsade med detta system eftersom de är bundna till de inneboende egenskaperna hos detta protein. Olika teoretiska ansatser har som syftar till att bygga en beskrivning av de icke-triviala mekaniska beteenden på singel-glödtråden nivå och har lett till bland annat olika skalning förutsägelser för beroendet av linjära elastiska platå skjuvning modulus, G 0 (dvs. nätverket ”elasticitet”), med avseende på koncentrationen (c) och lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Medan den koncentration skalning är åtkomlig i experiment med aktin-baserade eller andra modellsystem och teoretiska förutsägelser har varit strikt verifierade13,16,24, 25, skalningen med avseende på lp har förblivit experimentellt otillgängliga. Detta är dock en stor begränsning eftersom lp är också en oberoende variabel som är utmärkande för antalet semiflexible polymerer.

Detta centrala, naturlig begränsning som följer av den fasta lp av aktin eller andra biologiskt framställda polymerer, såsom kollagen har nyligen lösts genom att anställa kakel-baserade DNA-rör, som är reglerbart i deras mekaniska egenskaper 9 , 26 , 27 , 28. små variationer i arkitekturer av rören (t.ex. olika antal konstituerande DNA strandar inom enheten ring) ge distinkta värden för lp, som kan utvärderas via fluorescensmikroskopi, antingen genom att analysera en fluktuerande tub eller genom att utvärdera de böjda konfigurationerna av flera klibbade rör, som beskrivs tidigare9,28. Dessa analyser visade att lp värden av de olika tube populationerna varierar över mer än en storleksordning och att olika utvärderingstekniker ger konsekventa resultat9,28.

Överraskande, har den övergripande skalning av linjära elastiska platå skjuvning modulus G0 med avseende på koncentrationen och lp rapporterats vara inkonsekvent med alla tidigare teoretiska infallsvinklar 9, i synnerhet visar en mycket starkare än förutsedd beroende av lp. Dessa fynd betona värdet av nya modellsystem studera de centrala egenskaperna hos semiflexible polymerer. Anställa n-helix DNA rör dramatiskt breddar räckvidden för dessa undersökningar. Inte bara kan varieras fritt lp utan att ändra det grundläggande materiellt, men den inneboende programmerbara naturen av DNA kan aktivera att systematiskt granska ytterligare element som antipyridinantikropp eller kinetiska funktions processer. Dessutom dessa rör är lösligt i vatten och, i motsats till de flesta proteiner, stabila i adekvat pH och Joniska villkor för flera veckor, utan detekterbar nedbrytning9.

Att montera dessa rör, en diskret uppsättning DNA oligonukleotider används, som innehåller två domäner som delar kompletterande bassekvensbestämning till två närliggande strängar (på grund av den specifika sekvenser, inte en enda strand bildar strukturer såsom hårnålar). De kompletterande sekvenserna hybridisera på ett cykliskt sätt, bildar slutna, halv-överlappande ringar av n sammankopplade dubbel-spiralformade segment (figur 1A och B). Dessa ringar form på en diskret diameter (figur 1 c), och deras halv-överlappande konfiguration exponerar axiella klibbiga ändarna komplement till klibbiga ändarna av en annan ring. Denna selektiva tillägg av matchande oligonukleotider utlöser en stapling av ringen, vilket leder till effektiv polymerisation av trådlika DNA helix rör av storleksanpassa n (nHT). Sin kontur längder normalt mäta flera mikrometer i längden, och deras längd fördelning är jämförbar med aktin filament9,26,27,28. Det har visat för liknande DNA nanorör att de faktiskt uppvisar polymerisation kinetik liknar dem av aktin filament och mikrotubulip-klass = ”xref” > 29. Beroende på antalet n av individuella DNA-strängar som utgör den grundläggande Ringstrukturen, kan nHT arkitekturen, samt dess omkrets och diameter, controllably varieras. Använder fler DNA-strängar ökar omkretsen av ringar/rören, och motsvarande arkitektoniska ändring skiftar de mekaniska egenskaperna till högre lp -värden (figur 1 c), motsvarande en högre styvhet. På Mesoskopisk skala, översätta dessa större lp -värden till mindre böjd konformationer på grund av den högre styvheten (figur 1 d och E).

Protocol

1. beredning av n HTs Obs: här, n betecknar antalet olika enda DNA-strängar inblandade i bildandet av helix rören av en viss storlek. För n = 8, åtta olika enda DNA-strängar utgör en enhet ring. Köp DNA sekvenser (HPLC renhet grad eller högre) från en lämplig DNA-syntes tjänst eller utföra högkvalitativa syntes och rening (exemplariskt sekvenser anges i tabell 1). Omsuspendera frystorkade oligonukleotider i renat v…

Representative Results

Montering av DNA nanorör via en temperatur ramp (figur 2) är en mycket tillförlitlig metod att bilda dessa konstgjorda semiflexible polymerer. Dessa polymerer har jämförbara egenskaper till sina naturligt förekommande motsvarigheter, till exempel aktin filament, men ger en mycket bredare experimentella ram eftersom deras mekaniska egenskaper kan controllably ändras9,27 . Som biopolymerer, de ka…

Discussion

För att erhålla korrekt bildade nätverk, är montering DNA nanorör ett avgörande steg. Fel under syntesprocessen negativt tube kvaliteten; Det rekommenderas därför att HPLC eller en strängare process används för att rena oligonukleotider. Eftersom bildandet av diskreta snarare än aggregerade DNA nanorör, liksom deras längd distribution, beror på den equimolar stökiometri av de n konstituerande oligonukleotider inom den, är det nödvändigt att omvärdera koncentrationerna av köpta slingor, sedan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi erkänner att finansiering av DFG (1116/17-1) och Leipzig skola av naturvetenskap ”BuildMoNa” (GSC 185). Detta arbete har stötts genom Fraunhofer Attract projektet 601 683. T. H. erkänner finansiering från Europeiskasocialfonden (ESF-100077106).

Materials

AFM cantilever ACTA AppNano
AFM – NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore – Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

DNA NanotubesSemiflexible PolymersSoft MatterBiopolymersFilamentsNetworksHydrogelsCell MigrationStiffnessRheologyDNA HybridizationDNA StrandsThermocyclerSample PreparationDynamic Shear RheometerSample LoadingEvaporation Prevention
check_url/56056?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image