Summary
Vi beskriver en metode, hvormed vi identificere kritiske restkoncentrationer kræves for bindingen af menneskelige eller murine monoklonale antistoffer, der er målrettet den virale hemagglutinin af influenza A virus. Protokollen kan tilpasses til andre virus overflade glykoproteiner og deres tilsvarende neutraliserende antistoffer.
Abstract
Influenzavirus udviser en bemærkelsesværdig evne til at tilpasse og unddrage sig vært immunresponset. Én måde er gennem antigene forandringer, der sker på de overflade glykoproteiner af virus. Generation af undslippe varianter er en kraftfuld metode i belyse hvordan virus undslippe immun påvisning og identificere kritiske restkoncentrationer kræves for antistof bindende. Her, beskriver vi en protokol på hvordan man kan generere influenza A virus undslippe varianter ved at udnytte menneskers eller murine monoklonale antistoffer (papagøjesyge) rettet mod den virale hemagglutinin (HA). Med brugen af vores teknik karakteriseret vi tidligere har kritiske restkoncentrationer kræves til indbinding af antistoffer rettet mod enten hoved eller stilk af den roman aviær H7N9 HA. Protokollen kan være let tilpasses til andre virus systemer. Analyser af undslippe varianter er vigtige for modellering antigene drift, fastsættelse af enkelt nucleotid polymorfier (SNPs) giver modstand og virus fitness, og i udformningen af vacciner og/eller therapeutics.
Introduction
I lighed med andre RNA-virus, influenza-A-vira besidder en fejlbehæftet polymerase, der giver mulighed for generation af et væld af antigene varianter med hver runde af replikering1,2,3. Influenza virus har en forbløffende evne til at tilpasse og unddrage sig den menneskelige immunrespons via antigene drift, som er opnået gennem en akkumulering af mutationer på de overflade glykoproteiner, der fører til tab af antistof bindende. Antigene drift af de virale overflade glykoproteiner, HA og neuraminidasetypen (NA), nødvendiggør nødvendigheden af at omformulere og administrere vaccinen årligt.
Teknologiske fremskridt i isolation og generation af antigen-specifikke antistoffer har givet et stort antal af vaccine-induceret mAbs4,5,6,7,8. Karakterisering af epitoper af mAbs, der bredt neutraliserer influenza-A-vira har til gengæld stærkt hjulpet de udviklingen af flere universal influenza vaccine kandidater9,10,11, 12,13,14. Belyse de antigene fodaftryk af en mAb afslører de strukturelle determinanter for neutralisering og giver mulighed for en informeret tilgang til vaccine design. Men det er hverken realistisk eller omkostningseffektiv for laboratorier, der strukturelt karakterisere omfattende paneler af mAbs gennem røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi for at kortlægge epitoper virusantigen15, 16 , 17 , 18.
Røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi kræver dyrt udstyr, specialiserede teknikker og potentielt en omfattende mængde af tid til at generere data. En alternativ og hurtigere tilgang er udnytter den hurtige generation af forskelligartede viral befolkningsgrupper via det fejlbehæftede RNA-afhængige RNA polymerase til at generere undslippe mutanter Bestem epitoper mAbs19,20, 21,22,23. Generation af undslippe varianter kræver ikke nogen særligt udstyr eller teknik og kan udføres med konventionelle laboratoriereagenser og udstyr.
Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for kortlægning af kritiske restkoncentrationer kræves for mAb bindende at genkende influenza HA.
Protocol
forsigtighed: en række af influenzavirus i omløb i den menneskelige befolkning (fx, H1, H3) er biosikkerhed niveau 2 klasse patogener, der skal håndteres med omhu og korrekte personlige værnemidler. Håndtering af virus skal godkendes af den institutionelle Review Board. Følgende protokol godkendtes af den institutionelle Review Board på Mount Sinai.
Bemærk: HA-specifikke antistoffer, der hæmmer viral replikation kan generelt inddeles i i) dem, der binder på eller ved siden af receptor bindingssted på toppen af den kugleformede hoved og ii) dem, der binder distale af receptor binding domæne, der omfatter den laterale side af den kugleformede hoved og regionen stilk af HA. Antistoffer, der er målrettet receptor bindingssted forhindre engagement af sialic syre motiver på overfladen af target-cellerne og kan måles ved hjælp af en hemagglutination hæmning (HI) assay. Antistoffer, der er HI-negative, som stilk-specifikke antistoffer, kan stadig hæmmer viral replikation, men kan kun vurderes ved hjælp af neutralisering assays.
1. kategorisering antistoffer baseret på HI og neutralisering aktiviteter
- HI assay
- i en 96-brønd V-nederste plade, tilføje 25 µL 1 x PBS på kolonne 2 til 12.
- Fortyndes mAb 7B2 (hoved-specifik), 6F12 (stilk-specifik) 23 og en isotype kontrol til 100 µg/mL i 1 x PBS og alikvot 50 µL af de fortyndede antistof forberedelser i kolonne 1. Også omfatter en ingen mAb-kontrol ved at tilføje 50 µL 1 x PBS ( figur 1A).
- Udføre 2-fold serielle fortyndinger af antistoffer ved at overføre 25 µL fra kolonne 1 til kolonne 2, og så videre. Kassér de sidste 25 µL fra kolonne 12 ( figur 1A).
Bemærk: Sørg for at medtage en række af ingen antistofkontrol. - Fortyndes virus lager (reassortant virus udtrykker HA og NA af A/Californien/04/09 med de indre segmenter af A/Puerto Rico/8/34) til 8 hemagglutination enheder/25 µL fortyndet virus lager. Tilsæt 25 µL fortyndet virus materiel (8 hemagglutination) til hver brønd (rækker A til G).
Bemærk: Antistof og virus blandingen bør have en endelige mængden af 50 µL med en start endelig koncentration på 50 µg/mL. - Incubate plade ved stuetemperatur (RT) for 45 min.
- For rækken tilbagetitrering (H), tilføje 50 µL 1 x PBS på wells H2 til H12. Tilsæt 100 µL af 8 hemagglutination enheder/25 µL til H1. Seriefremstillede fortyndes to gange ved at overføre 50 µL fra H1 til H2, og så videre. Kassér de sidste 50 µL fra godt H12. Endelig tilsættes 50 µL af 0,5% kylling røde blodlegemer (RBC) til alle pladens huller, 96-brønd V-bund.
Bemærk: MAb prøver i analysen bør have en endelige mængden af 100 µL: mAb (25 µL), virus (25 µL) og RBC (50 µL). Den endelige mængden af kontrolelementet ingen mAb bør indeholde 25 µL 1 x PBS, 25 µL af virus og 50 µL af RBC. - Incubate plade ved 4 ° C i 1 h.
- Læse visuelt plader til HI aktivitet. Hvis der er en positiv udlæsning til en bestemt antistof, Fortsæt til trin 2.1 til at generere undslippe varianter. Hvis antistoffet er HI-negative, Fortsæt nedenfor til trin 1,2 at vurdere, om antistoffet har neutralisere aktivitet i en celle kultur assay.
Bemærk: En positiv udlæsning af en HI-aktive mAb er angivet med en mørk rød RBC pellet i midten af en brønd ( figur 1B 7B2), der vil danne en tåre drop når 96-brønd V-bundplade er holdt i en 45 ° vinkel. En negativ udlæsning vil ikke danne en mørk rød RBC pellet i brønden ( figur 1B 6F12 og ingen mAb). Kontrolelementet isotype vil også danne en mørk rød RBC pellet ikke og bør ser identisk med stilk-specifikke antistof, 6F12 eller den ingen mAb styre prøve ( figur 1B) 23.
- Microneutralization analyse
- plade Madin Darby Canine nyre (MDCK) celler med en tæthed på 2 x 10 4 celler/brønd i en vævskultur behandlet 96-brønd plade og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 til 17-19 h .
Bemærk: Cellerne kan også være tilladt at tiltræde i bunden af brønden i mindst 4 timer før brug. - i en separat 96-brønd plade, udføre syv 3-fold serielle fortyndinger af det humane mAb 4D 05 5, CR9114 17 eller isotype IgG kontrol, ved en begyndende koncentration på 200 µg/mL i 1 X Minimal afgørende Medium (MEM) suppleret med tosyl phenylalanyl chlormethyl keton (TPCK)-behandlet trypsin (1 µg/mL) ( figur 2).
Bemærk: Række A bør indeholde 75 µL fortyndede antistof (begyndende koncentration på 200 µg/mL). Seriefremstillede fortyndes (3-fold) ned på pladen ved at overføre 25 µL fra række A til række B, og så videre. Rækker A til H bør have en endelige mængden af 50 µL. Der er ingen grund til at ændre tips i mellem fortynding overførsler. - Fortyndes virus lager (reassortant virus at udtrykke for HA og NA af A/Shanghai/1/13 med den interne segment af A/Puerto Rico/8/34) til en 100 af 50% vævskultur infektiøse dosis (TCID 50) / 50 µL 1 x MEM suppleret med TPCK-behandlede Trypsin (1 µg/mL) 24. Tilføje 50 µL/brønd af fortyndede virus til antistof præparater (trin 1.2.2). Tilføje 50 µL 1 X MEM til ikke-inficerede celle-kontrolhullerne.
- Ruger virus-antistof blandinger i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) for 1 h.
Bemærk: Virus-antistof blandinger skal have en samlet maengde paa 100 µL: 50 µL antistof fortynding (trin 1.1.2) og 50 µL af virus indeholdende 100 TCID 50 (trin 1.2.3). - Opsug medier i brøndene og tilføje den hele 100 µL af virus-antistof blandinger til tilsvarende wells.
Bemærk: Aspiration er gjort ved hjælp af en 8-kanal indsugningsventil adapter er knyttet til et vakuum. Alternativt, en 8 - eller 12-godt mikro-multikanalpipette kan anvendes til manuelt Aspirér. Alle aspiration under inokulum fjernelse eller vasker er gjort fra den højeste koncentration af antistof til det laveste, uden at skulle ændre tips. - Vask éncellelag med 200 µL 1 x PBS. Opsug 200 µL 1 x PBS (som i trin 1.2.5). Gentag vask en gang mere for en total på to skylninger.
- Inficere éncellelag MDCK celler ved at tilføje den hele 100 µL/brønd af virus-antistof blandinger (fra trin 1.2.4) på éncellelag og inficere/inkuberes ved 37 ° C (med 5% CO 2) for 1 h.
- i løbet af infektionen, i en separat 96-brønd plade, forberede et andet sæt af antistof fortyndinger. Tilsæt 150 µL af 100 µg/mL af den respektive antistof i række A og 100 µL 1 x MEM suppleret med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL) i rækker B til H. udføre 3-fold fortyndinger overføre 50 µL fra række A til række B , og så videre ned til Row H. kassere de sidste 50 µL fra række H. Den samlede mængde for hver godt bør lig 100 µL. de udtagne.
Bemærk: Antistoffer er fortyndet i 1 x MEM suppleret med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL). - Opsug virus-antistof inokulum fra éncellelag i trin 1.2.7 og genopbygge med den hele 100 µL/brønd af passende antistof fortynding tilberedes i trin 1.2.8.
Bemærk: Hvis et godt indesluttet en endelig-antistof koncentration på 100 µg/mL under infektion (trin 1.2.7), så efterfyldning medierne bør også indeholde en endelig-antistof koncentration på 100 µg/mL (trin 1.2.8). - Incubate for 24 h i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Opsug medier fra 96-brønd plader og vaskes tre gange med 200 µL/brønd af 1 x PBS.
- Fix cellerne med 100 µL koldt 80% acetone i 1 timer ved -20 ° C.
Bemærk: 80% acetone fortyndingen i dobbelt destilleret (dd) H 2 O (f.eks., 80 mL 100% acetone plus 20 mL af Hedeselskabet 2 0). 80% acetone løsning kan være kølet på is før brug. - Cellerne med 200 µL/brønd af 1 X PBS vaskes tre gange.
- Blok plader med 200 µL/brønd 5% mælk fortyndet i 1 X PBS og inkuberes plader på RT for 1 h.
- Tilsættes 100 µL af biotinylated Anti-influenza en nucleoprotein (NP) primære antistof fortyndet 1:2,000 i 1 x PBS/1% bovint serumalbumin (BSA), og der inkuberes plader på RT for 1 h.
Bemærk: For B influenzavirus, en influenza B virus-specifikke anti-NP antistof bør anvendes. - Vaske pladerne med 1 x PBS tre gange.
- Tilsættes 100 µL af streptavidin - peberrodspulver peberrodsperoxidase (HRP) konjugerede antistoffer fortyndet 1:3,000 i 1 x PBS/1% BSA og inkuberes plader på RT for 1 h.
- Vaske pladerne med 200 µL 1 x PBS tre gange.
- Tilføje HRP substrat reagens på 100 µL/brønd og Inkuber i mørke ved RT.
Bemærk: Inkubationstiden bør optimeres før tilsætning af sure stoppe buffer (nedenfor). Generelt, 15-30 min. er tilstrækkelig. - Dæmpning reaktion med 50 µL/hul 5 M HCL.
Forsigtig: 5M HCl er en stærkt ætsende reagens, der kan forårsage skader på øjne, hud og slimhinder. Tilføjelsen af dette reagens skal ske under en ventileret hætte med passende personlige værnemidler. - Læse plader ved 492 nm og fratræk baggrund (ikke-inficerede celler) wells.
- Beregner den procentvise hæmning med følgende formel:
- Hvis et antistof har neutralisering aktivitet (og ingen HI aktivitet), Fortsæt til trin 2.2.
Bemærk: Antistoffer, der mangler i vitro neutralisering aktivitet vil mangle HI aktivitet.
- plade Madin Darby Canine nyre (MDCK) celler med en tæthed på 2 x 10 4 celler/brønd i en vævskultur behandlet 96-brønd plade og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 til 17-19 h .
2. Generation af undslippe Mutant varianter
bemærkning: neutraliserende antistoffer, der har eller mangel på HI aktivitet analyseres yderligere med de særlige protokoller er beskrevet nedenfor.
- Protokol 1: HI-positive/neutralisering-positive antistoffer ( figur 3A )
- forberede en virus bestand af 10 6 plak danner enheder/milliliter (PFU/mL) i 1 x PBS i en 400 µL volumen.
- Udarbejde fire fortyndinger af antistof af interesse i stigende koncentrationer (f.eks. 0, 0.5, 0,05 og 0,005 mg/mL) i 1 x PBS i et volumen på 100 µL pr. fortynding.
Bemærk: Wild-type virus bør altid være passaged parallelt og i mangel af antistof. Sekvenser af disse passaged virus vil hjælpe med at skelne mellem tilpasning til celle kultur betingelser og undslippe mutationer. - Mix 100 µL af 10 6 PFU/mL af virus med 100 µL af hver antistof fortynding eller 100 µL 1 x PBS.
- Incubate 1 h i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2). Vortex kort. Injicere 200 µL af hver blanding i specifikke-patogen gratis (SPF) befrugtede hønseæg.
- Inkuber æg ved 37 ° C (uden CO 2) for 40-44 h.
- Ofre virus inficeret befrugtede æg ved at inkubere ved 4 ° C i mindst 6 h.
- Høst allantoisvæske fra æg, som tidligere beskrevet 24 , 25.
- Udføre hemagglutination analyse, som beskrevet ovenfor 24 , 26. Hvis alle de allantois flydende præparater ikke har hemagglutination titers, Gentag fra trin 2 med antistof fortyndinger spænder fra 0,005 mg/mL til 0.00005 mg/mL.
Bemærk: En mætte koncentration af en HI-positive antistoffer kan neutralisere alle de viruspartikler til stede. Derfor kan det være nødvendigt at reducere mængden af antistof i den passaging. - Bekræfte undslippe varianter ved at udføre HI assay 24 (trin 1.1).
Bemærk: HI-aktive antistoffer blokere HA engagement af sialic syre motiver på target-cellerne. Derfor, en virus i nærværelse af dens beslægtet antistof mister evnen til at agglutinere røde blodlegemer (tilstedeværelse af RBC pellet). Teoretisk, undslippe varianter af HI-aktive antistoffer kan stadig binde sialic syre motiver selv i nærværelse af dens beslægtet antistof og dermed kan agglutinere røde blodlegemer (ingen RBC pellet). Hvis HI antistof af interesse er stadig detekterbar, Gentag protokol fra trin 2.1.2 med en højere start koncentration af antistoffet.
- Protokol 2: HI-negativ-neutralisering-positive antistoffer ( figur 3B )
Bemærk: for at generere undslippe varianter mod neutraliserende antistoffer, der mangler HI aktivitet, virussen skal være passaged i nærværelse af stigende mængder af antistof.- Plade MDCK celler i en 6-godt plade med en tæthed på 1 x 10 6 celler/brønd og Inkuber i et minimum af 4 h i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Fortyndet virus materiel til 10 6 PFU/mL eller virus fra tidligere passage i 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL) i en 500 µL volumen.
- Laves en enkelt fortynding af antistof (0,02 mg/mL, for den oprindelige passage eller højere for alle efter passager) i 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin i en 250 µL volumen.
- Blanding 250 µL fortyndet virus med 250 µL fortyndede antistof (+ antistof) eller 250 µL 1 x MEM (ingen antistofkontrol).
- Ruger virus-antistof blandingen i 30 min. i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Aspirat medierne ved hjælp af et glas Pasteur afpipetteres og vaske éncellelag af celler med 1 mL af 1 X PBS.
- Tilsættes 500 µL af blandinger i brøndene og Inkuber i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) for 1 h.
- Efter 1 h, supplere brønde med 2 mL 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL).
- Kontroller cellerne i 48 timer efter infektionen for tegn for cytopatisk effekt (CPE) på mikroskop eller udfører en hemagglutination analyse til påvisning af viral vækst 26.
- Hvis der er grov CPE i de kulturer, suppleret med antistof, høste supernatanten i flere cryo-rør, etiket med passage nummer og opmagasinere henne ved-80 ° C.
- Spar 100 µL af supernatanten at inficere en frisk éncellelag af MDCKs med 2 mL 1 x MEM suppleret med TPCK-trypsin og antistof. Husk at medtage en ingen antistofkontrol for hver passage.
Bemærk: Øge koncentrationen af antistoffet af dobbelt (eller skøn af forskeren) i den næste passage (hver to dage). - Øge koncentrationen af antistof i hver efterfølgende passage indtil virusets vækst er stadig er levedygtig selv med en endelig koncentration på 0,6 mg/mL af antistof. Fryse de flere hætteglas af supernatanten af hver passage og opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Ingen antistofkontrol er afgørende for at kontrollere væksten af virus fra en passage til et andet. Hvis der er grov CPE i kontrolelementet ingen antistof, men ingen CPE i den + antistof gruppe, dette viser, at koncentrationen af antistoffet var for høj og ingen undslippe varianter blev genereret. Hvis der er brutto CPE i kontrolelementet ingen antistof, men kun moderat CPE i den + antistof gruppe, dette indikerer tilstedeværelsen af potentielle undslippe varianter. I den næste passage, hævemidler passage til 200 µL af supernatanten og opretholde koncentration af antistof mod øger sandsynligheden for at generere undslippe varianter.
3. Isolering af undslippe varianter gennem Plaque rensning
- plade MDCK celler i en 6-godt plade med en tæthed på 1 x 10 6 celler/brønd og Inkuber i et minimum af 4 h i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Fortyndes antistoffer i 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin starter ved 300 µg/mL i et volumen på 250 µL og blandes med 250 µL af tilsvarende undslippe mutant virus. Virus passaged i mangel af antistof bør også plaque renset.
- Opsug medier fra cellerne, vask med 1 x PBS tre gange og tilføje den hele 500 µL af virus-antistof blanding (trin 3.2).
- Ruger plader til 1 h i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) og sørg for at klippe frem og tilbage hvert 10 min for at forhindre udtørring af éncellelag.
- Opsug virus-antistof blandinger og fylde brøndene med overlay agar medier indeholdende tilsvarende mængder af antistof (300 µg/mL, trin 3.2).
- Ruger plade for 40-44 h i et 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Cirkel synlige plaques med en blå eller sort farvet markør til at lette plaque picking.
- Pluk fire plaques for hver undslippe mutant virus-antistof kombination samt wild-type virus, der var passaged i MDCK celler eller æg i mangel af antistof.
- Resuspend plak i 100 µL 1 x PBS.
- Tilføre 10 - dage gamle SPF befrugtede hønseæg plaque renset undslippe mutant virus hele 100 µL.
- Inkuber æg til 40-44 h i et 37 ° C inkubator (uden 5% CO 2).
- Udfører en hemagglutination analyse for at bekræfte tilstedeværelsen af virus (trin 1.1).
4. Udvinding af Viral RNA og analyse af HA sekvens Variation
- ekstrakt af viral RNA fra 200 µL af undslippe mutant virus allantoisvæske med en mono-phasic løsning af phenol og guanidin isothiocyanat.
Forsigtig: Phenol er en flygtig flydende reagens, der kan medføre hoste, åndenød og moderat irritere huden ved kontakt. - Forstærker HA segment fra den viral RNA med anvendelse af en reverse transkriptase og gen-specifikke primere for influenza A HA segment 27.
Bemærk: De universelle primere for B influenzavirus i tabel 2 beskrevne forstærke både HA (~ 1.800 bp) og NA (~ 1.500 bp) 28. - Løse RT-PCR-produktet i en 1%-agarosegel og skåret ud af korrekt størrelse band (~ 1.800 bp).
- Gel ekstrakt PCR produkt ved hjælp af en silica-membran baseret rensning procedure og sende cDNA til sekvensering.
- Identificere aminosyre rester kræves for antistof bindende ved at differentiere mutationerne findes på formodede undslippe varianter og passaged wild-type virus på grund af enten celle kultur tilpasning eller immunologiske udvalg.
- Klon af PCR produkt, der indeholder wild-type eller flygte variant HA til et pCAGGs udtryk vektor (NotI og NheI).
- Bindende antistof til flygte variant HA kan vurderes med én af to muligheder (eller begge) beskrevet nedenfor.
5. Antistof bindende analyser af undslippe varianter
- immunofluorescens
- plade 293T celler med en tæthed på 2 x 10 4 celler/brønd i en 96-brønd plade og Inkuber i 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) i 24 timer.
- Transfect celler med 0,10 µg/brønd af pCAGGS plasmider kodning undslippe mutant HA, virus passaged HA, og wild-type HA (unpassaged) med brug af en Transfektion reagens.
- Ruger 96-brønd plader for 48 h i 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Fix med 100 µL af 0,5% PARAFORMALDEHYD for 15 min på RT.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er en flygtig flydende reagens, der kan medføre hoste, åndenød og moderat irritere huden ved kontakt. Det er blevet udpeget som et potentielt kræftfremkaldende. Tilsætning af reagens bør ske i et udluftet kemiske hood. - Vask med PBS 1 x tre gange. Blok med 5% mælk i 1 x PBS for 1 h på RT.
- Vaskes med 1 x PBS tre gange. Der inkuberes med 5 µg/mL af antistof af interesse for 1 h på RT.
- Incubate med 100 µL af sekundær antistof (anti-menneskelige eller anti-mus Alexa 488) på en fortynding af 1:2,000 i 1 x PBS/1% BSA i 1 time på RT i mørke.
- Vaskes med 1 x PBS tre gange. Observere celler på et fluorescerende mikroskop for positive eller negative farvning.
- Fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)
- plade 293T celler med en tæthed på 2 x 10 5 celler/brønd i en 6-godt plade og inkuberes ved 37 ° C (med 5% CO 2) for 24 h.
- Transfect celler med 0,50 µg/brønd med pCAGGS plasmider kodning undslippe mutant HA, virus kun passaged HA, og wild-type HA med brug af en Transfektion reagens.
- Ruger 6-godt plader i 48 timer ved 37 ° C (med 5% CO 2).
- Efter 48 h, Aspirér vækst medier og vask med 1 x PBS to gange forsigtigt (at sikre, at éncellelag er uforstyrret).
- Høst transfekteret 293T cellerne med 500 µL af FACS buffer (1 x PBS/2% føtalt kalveserum).
Bemærk: FACS buffer bør være pre nedkølet ved 4 ºC inden brugen. - Centrifugeres høstede 293T celler ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Opsug FACS buffer, og pelleten med 200 µL af FACS buffer indeholdende mAbs af interesse (endelig koncentration på 1 til 5 µg/mL). Der inkuberes ved RT i 20 min.
- Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. vaskes to gange med 500 µL af FACS buffer. Opsug omhyggeligt med et glas Pasteur pipette, ikke forstyrre pelleten.
- Resuspend med 200 µL af FACS buffer indeholdende sekundær antistof konjugeret med Alexa 488 (endelig fortynding på 1:1, 000). Inkuber i mørke ved 4 ° C i 20 min.
- Centrifugeres celler ved 300 g i 5 min. ved 4 ° C. vaskes to gange med 500 µL af FACS buffer og omhyggeligt Opsug vaskebuffer.
- Resuspend i 500 µL af FACS buffer og vurdere binding af mAbs og/eller polyklonale sera til celler transfekteret med HA af FACS.
Bemærk: Husk at medtage en ingen mAb/polyklonale sera kontrol samt en untransfected prøve i eksperimentet.
Representative Results
Vi har tidligere brugt variationer af denne metode til at generere undslippe varianter til menneskelig og murine mAbs induceret af den sæsonbestemte influenza virus vaccine, H7N9 vaccination eller sekventiel DNA/rekombinant HA protein vaccination4,5 ,6,7. Som beskrevet ovenfor, var antistoffer først karakteriseret ved hjælp af HI og microneutralization-assays for at informere os om hvilken specifik protokol til at fortsætte med næste4,5. Antistoffer 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07 4E02 og 07-4D 05 fandtes for at have HI og neutralisering aktiviteter mod aviær H7N9 virus (A/Shanghai/1/2013) (tabel 1), og dermed protokol 1 (trin 2.1) blev udnyttet. For mAbs med neutralisere at manglende HI aktivitet, som 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 og S6-B01 (tabel 1), blev protokol 2 (trin 2.2) brugt til at generere undslippe varianter. Undslippe mutant kortlægning afslørede, at mange af antistofferne genkende kritisk rester i forskellige steder på viral HA4,5 (figur 4). Mens fleste af HI-positive antistoffer har undslippe mutant rester nær tidligere rapporteret antigene lokaliteter af den H7 HA, genereret HI-negative antistoffer undslippe mutanter med punktmutationer i stilk region4,5 .
| Antistof | Hej aktivitet | NEUT aktivitet |
| 07-5D 03 | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5G 01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4D 05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
Tabel 1: Tabel over antistof HI og neutralisering aktivitet. Ti H7-specifikke mAbs isoleret fra personer vaccineret med en eksperimentel vaccine, H7N9 udstiller forskellige in vitro- antiviral aktiviteter5.
| Videresende Primer (5' til 3') | Vende Primer (5' til 3') | Thermocylcer betingelser | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 42 ºC for 60 min, 94 ºC for 2 min/5 cyklusser af 94 ºC for 20 s, 50 ºC for 30 s og 68 ºC til 3 min. 30 s, efterfulgt af 40 cyklusser af 94 ºC for 20 s, 58 ºC for 30 s , og 68 ºC for 3 min 30 s med gangen endelige udvidelse på 68 ºC i 10 min | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 45 ºC for 60 min, 55 ºC i 30 min, 94 ºC for 2 min/5 cyklusser af 94 ºC for 20 s, 40 ºC for 30 s og 68 ºC til 3 min. 30 s, efterfulgt af 40 cyklusser af 94 ºC for 20 s , 58 ºC for 30 s og 68 ºC for 3 min 30 s med gangen endelige udvidelse på 68 ºC i 10 min | |||||||
Tabel 2: Universal influenza virus primere. Primer par til forstærkning af HA segmenter af influenza A27 og B28 vira og deres respektive thermocycler betingelser.
Figur 1: HI assay. (A) A skematisk for at etablere en HI assay til test aktivitet af to mus H1-specifikke mAbs 7B2 (hoved-specifik) og 6F12 (stilk-specifik) ved hjælp af V-bundplade med 96 brønde, og (B) et eksempel på resultaterne af en HI assay23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Microneutralization assay. En skematisk for at konfigurere en microneutralization analyse til at teste aktivitet af to menneskelige mAbs 4D 055 og CR911417. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Generation af undslippe mutanter. Den metode foreslog vil være afhængig af HI og microneutralization aktivitet udstillet af antistoffet. Generation af undslippe mutanter mod (A) kan neutraliserende HI-positive antistoffer kræve en enkelt passage i æg, mens (B) neutraliserende HI-negative antistoffer kan indebære flere passager med stigende antistof beløb i celle vævskultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: et eksempel på en epitop kort af den roman aviær H7N9 HA genereret med undslippe mutant varianter. Vaccine-induceret antistoffer isoleret fra personer vaccineret med en kandidat H7N9 influenza en vaccine blev brugt til at generere undslippe mutant varianter. Hver restkoncentration angivet i rød repræsenterer placeringen af kritiske aminosyrer kræves til effektiv bindingen af en mAb. Data blev tilpasset fra Dunand-Henry et al., 20154. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Selv om størstedelen af restkoncentrationer identificeret via undslippe mutanter er præcise, er en af de store forbehold i denne tilgang at punktmutationer undslippe varianter ikke kan nødvendigvis kort inden for den molekylære fodaftryk af antistof som fastsat af strukturanalyser. Dette skyldes en mutation på visse rester evne til at føre til en konformationel ændring distalt for placeringen af det muterede rester, svarer til en allosteriske effekt. En anden begrænsning er, at denne metode kun kan gennemføres for neutraliserende antistoffer; antistoffer, der mangler i vitro selektivt pres vil ikke føre til undslippe mutanter. Men denne begrænsning kan overvindes med brug af et panel af undslippe varianter genereret af tidligere karakteriseret neutraliserende antistoffer. Tan et al. anvendte en flygte variant af en neutraliserende mAb til H7N9 virus for at kortlægge epitop for et ikke-neutraliserende antistof7.
Ikke desto mindre giver belyse epitoper af antistoffer gennem generation af undslippe varianter et levedygtigt alternativ til krystallografi og cryo-Elektron Mikroskopi, som begge kræver en omfattende investering i udstyr. Andre alternativer er at bestemme den minimale bindende region mAbs ved hjælp af alanin scanning eller peptid scanning/trunkering mutanter. Alanin scanning mutagenese kan kræve et betydeligt arbejde i at skabe et stort antal varianter under screening29, mens peptid scanning er begrænset til lineære epitoper30. De i denne protokol beskrevne metode kræver ingen speciel udstyr eller teknik og faktisk gør brug af eksisterende in vitro- neutralisering assays modificeret til at generere undslippe varianter af antistoffer af interesse.
Protokol for generere undslippe varianter, der kræver flere passager (fx, stilk-specifikke antistoffer) er stærkt afhængige af den begyndende koncentration af antistof i passage 0. Det er bedre at fejle på siden af forsigtighed og starte på en log til halv en log, der er lavere end den halve maksimal hæmmende koncentration af et antistof og giver mulighed for robust virusets vækst. Forskeren kan spekulere, at en høj titer virus kultur i overværelse af immunologiske lavtryk vil have en stor genetisk variation i viral befolkning. Undslippe varianter kan vælges til ved gradvist at øge koncentrationen af antistof i de følgende passager. I tilfælde af, at virus væksten aftager, kan mængden af viral supernatanten øges i den næste passage samtidig bevare den samme mængde antistof koncentration i de tidligere passage.
Et flertal af universal influenzavacciner sigter mod at fremkalde en robust antistofrespons mod regionen stilk af HA. Analyser af undslippe varianter til stilk-specifikke antistoffer er vigtige i at definere forholdet mellem influenza virus fitness og immunologiske pres. Interessant, var undslippe mutant virus som følge af stilk-specifikke mAbs alle svækkede i vivo i murine LD50 undersøgelser4. Disse undersøgelser giver en stærk sag for stilk-baserede vaccination platforme. Derudover kunne denne protokol bruges til at identificere undslippe mutanter til andre anti-virale forbindelser, såsom lille molekyle hæmmere. Endelig, denne metode er ikke begrænset til influenza virus overflade glykoproteiner, men også kan anvendes mere bredt til at bestemme epitoper af andre virale glykoproteiner.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette projekt har været finansieret delvist med føderale midler fra det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme, National Institutes of Health, Department of Health og Human Services, under CEIRS kontrakt HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); og P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
References
- Shaw, M. L., Palese, P. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
- Nelson, M. I., Holmes, E. C.
- Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).
- Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
- Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).
- Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
- Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
- Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
- Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257 (2016).
- Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
- Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
- Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
- Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
- Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Geneva: World Health Organization. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421 (2015).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057 (2010).
- Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
- Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
- Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
- Chen, C. -W., Chang, C. -Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417 (2017).
