ويصف هذا البروتوكول منهجية الفائق للشاشة وظيفيا للإرث القائم على البروتين في S. cerevisiae.
ترميز المعلومات البيولوجية التي يمكن الوصول إليها لأجيال المستقبل عموما يتحقق عن طريق إدخال تغييرات على تسلسل الحمض النووي. الوراثة المعمرة المشفرة في البروتين المطابقة (بدلاً من تسلسل) منذ فترة طويلة وتعتبر تحول النموذج ولكن نادرة. أفضل الأمثلة تتسم هذه عناصر جينية هي البريونات، التي تمتلك سلوكاً ذاتيا تجميع التي يمكن أن تدفع بمظاهر جديدة تعمل الموروثة. البريونات التوراتية العديد من عرض تحيز تسلسل N/Q-الأغنياء ملفتة للنظر وتجميع في حظيرة اميلويد. وقد أبلغت هذه الميزات غير عادية معظم جهود الفحص لتحديد جديد بريون البروتينات. ومع ذلك، عدم إيواء ثلاثة على الأقل البريونات المعروفة (بما في ذلك بريون المؤسسين، الحزب الثوريSc) هذه الخصائص البيوكيميائية. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب بديل للتحقيق في نطاق الإرث القائم على البروتين يستند إلى خاصية العمل الجماعي: overexpression عابرة من بروتينات بريون يزيد التردد الذي يحصلون تكيف قولبة المتمتعة بالحكم الذاتي. وتصف هذه الورقة أسلوباً لتحليل قدرة الخميرة أورفيومي للحصول على الإرث القائم على البروتين. باستخدام هذه الاستراتيجية، وجدنا سابقا أن > 1% بروتينات الخميرة يمكن أن تغذي ظهور الصفات البيولوجية التي كانت طويلة الأمد ومستقرة، وقد نشأ أكثر من الطفرات الوراثية. يمكن استخدام هذا النهج في إنتاجية عالية عبر أورفيوميس كامل أو كنموذج فحص المستهدف للشبكات الجينية المحددة أو المحفزات البيئية. مثلما شاشات الجينية إلى الأمام تعريف المسارات الإنمائية وإشارات عديدة، تقدم هذه التقنيات منهجية للتحقيق في تأثير الوراثة على أساس البروتين في العمليات البيولوجية.
كثيرا ما تواجه النظم البيولوجية تقلبات عابرة في وفرة البروتين. لم يتضح ما إذا كانت هذه يكون لها تأثير دائم في تشكيل النمط الظاهري للكائن الحي أو للأجيال المقبلة. الحالات الأكثر شهرة من هذه الأحياء تشمل فئة نادرة من البروتينات، البريونات، التي تدفع ظهور السمات الموروثة دون تعديل الجينوم. بدلاً من ذلك، يحيل هذه الجسيمات فيكتيوس تيناسيوس و في بروتعمل عن طريق تغييرات مستديمة للبروتين المطابقة1،2. تم اكتشاف هذا النوع من الميراث كسبب لأنماط الإرث غير عادية من مرض الأعصاب المدمرة. ومع ذلك، أظهرت الدراسات في الكائنات الحية بدءاً من الفطريات للثدييات4،3،5،7،،من68،،من910 منذ ذلك الحين أن عناصر مثل بريون يمكن أن يضفي قيمة تكيفية. ومع ذلك، قد يعتبر البريونات رائعة لكنها نادرة غرائب البيولوجية.
ويعقد هذه الحكمة السائدة في الجزء لتوصيف الإرث القائم على البروتين طويلة قد تم تقييدها من قبل مجموعة صغيرة من الأمثلة. جهود الفحص المنهجي الأخيرة اتسعت هذه الصورة إلى حد كبير بتحديد عدة البريونات حسن النية الجديدة11 والبروتين تقريبا أربعة وعشرين المجالات12 مع القدرة على تحويل الوقود مثل بريون conformational. ومع ذلك، نظراً لأن هذه النهج قد تركز عموما على التحيزات القائمة على تسلسل الأحماض الأمينية القوية، البريونات التي تم اكتشافها تشترك في الخصائص البيوكيميائية للمؤسسين الخميرة البريونات [هذه المبادرة+]13،14و [URE3]15، و11،[RNQ+]16. وتشمل هذه: 1) وحدات المجالات التي هي غنية في البوليمر طويلة تمتد من الهليونين (N) والجلوتامين (Q)، 2) الجمعية إلى اميلويد [بريون+] تكيف17،،من1819، و 3) إكمال الاعتماد على ديساجريجاسي الدالة Hsp104 لإكثار المؤمنين من الأم إلى الابنة13،،من2021. والواقع أن الكثير من حسن النية البريونات، بما في ذلك [غار+]، [Het-s]، وحتى بريون الأصلي (PrPاتفاقية استكهولم)، سوف تضيع تحت هذه المعايير الصارمة. وربما الأهم من ذلك، أنهم سيكون غير قادر على التقاط أي آليات جديدة من الإرث القائم على البروتين22. وهكذا، قد يكون اتساع هذه الظواهر البيولوجية الحقيقية الآن أكثر شيوعاً في الطبيعة مما يفترض مسبقاً.
للتحقيق في هذه المسألة، كان يعمل في استراتيجية الفائق والبروتين على نطاق المنظومة. من السمات مميزة البريونات كافة، بما في ذلك الحزب الثورياتفاقية استكهولم، [غار+]، و [Het-s]، أن overexpression عابرة من البروتينات المسببة بشدة يزيد معدل بريون اقتناء15،،من2324،،من2526. وقد اتخذنا الاستفادة من هذه الميزة أن تسأل بشكل منهجي، عبر الكامل الخميرة أورفيومي، إذا كانت الدول المستندة إلى البروتين، وجينيه مستقرة يمكن الشروع في طريق عابر حمل overexpression البروتينات الفردية. ومن المعروف جيدا أن overexpression البروتين يمكن أن يغير تعمل27. ومع ذلك، بروتينات بريون غير عادية لعلى الإفراط في إنتاج مؤقت ينتج تغيير في النمط الظاهري هو الموروثة لعدة مئات من الأجيال بعد أوفيريكسبريشن الأولى. وقد لاحظنا سابقا الاستفادة من هذه الميزة، فضلا عن أنماط الإرث غير عادية من العناصر الوراثية المستندة إلى البروتين، التعرف على العشرات من البروتينات التي قادرة على هيريتابلي إعادة الأسلاك المظهرية المناظر الطبيعية دون تغيير الجينوم28. على الرغم من أن بعض التعرف على البروتينات كانت معروفة سابقا البريونات، معظم لم تكن، مما يؤكد قوة هذا النهج للكشف عن أشكال جديدة من الإرث القائم على البروتين.
وحددت البريونات الخميرة الأولى تعمل غير عادية وأنماط محيرة من الميراث. خصائص هذه البريونات ثم استخدمت لبناء الخوارزميات والأدوات الحاسوبية للشاشة لبروتينات بريون إضافية. الأسلوب الموصوفة هنا، على النقيض من ذلك، التجريبية وتعتمد على overexpression عابرة لإنشاء دائم التغير في ثابت ترميز الدولة…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر تشاكرابورتي سوني وساندرا جونز وديفيد غارسيا، بولار بهوبيندر، تشانغ إميليا، أنها ريتشارد وسوزان لندكست لمساعدتها في تطوير الاختبارات المستخدمة في هذه الورقة، فضلا عن المراجعين لتعليقاتهم مدروس.
Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |