JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Transplantatie van Schwann cellen binnen PVDF-TrFE Conduits verbeelde Rat ruggenmerg stronken ter bevordering van de regeneratie van het Axon over de kloof overbruggen

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Dit artikel beschrijft een techniek om het invoegen van een holle buis tussen de stronken van de ruggenmerg na volledige transect en vullen met cellen van Schwann (gcv) en injecteerbare kelder membraan matrix bevorderen van axon regeneratie over de kloof te overbruggen.

Abstract

Onder de verschillende modellen voor dwarslaesie bij ratten, wordt de kneuzingen model het vaakst gebruikt omdat het is het meest voorkomende type van menselijke dwarslaesie. Het volledige transect model, is hoewel niet als klinisch relevant als het model van kneuzingen, de meest rigoureuze method to evaluate methode axon regeneratie. In het model van kneuzingen is het moeilijk te onderscheiden van geregenereerde van gekiemde of bespaard axonen als gevolg van de aanwezigheid van het resterende weefsel post schade. In het volledige transect model is een “passerelle” methode nodig om de leemte opvullen en continuïteit maken vanuit de rostraal de caudal stompen om te evalueren van de doeltreffendheid van de behandelingen. Een betrouwbare “passerelle” operatie is essentieel voor het testen van resultaat maatregelen door het verminderen van de variabiliteit als gevolg van de chirurgische methode. De hier beschreven protocollen worden gebruikt voor het bereiden van Schwann cellen (gcv) en leidingen voorafgaand aan de transplantatie, volledige transect van het ruggenmerg thoracale niveau 8 (T8), invoegen van de leiding en SCs transplantatie in de leiding. Deze aanpak maakt ook gebruik van in situ gelerend van een injecteerbare kelder membraan matrix met SC transplantatie waarmee verbeterde axon groei over de rostraal en caudal interfaces met het weefsel van de gastheer.

Introduction

Spinal cord injury reparatie is een complex en uitdagend probleem dat een strategie van de combinatorische behandeling met betrekking tot vergt, bijvoorbeeld, het gebruik van cellen en een biomaterial te voorzien van een gunstige communicatie voor getransplanteerde cel functie en axon herstel op de site van letsel. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 en volledige transect10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modellen worden vaak gebruikt om te beoordelen van de effecten van de biomaterial gebaseerde “passerelle” therapieën. Het voordeel van het gebruik van een hemisection model is dat het meer stabiliteit voor de “passerelle” constructie in vergelijking met volledige transect biedt. In de hemisection modellen is het echter moeilijk te bewijzen van axon regeneratie als resultaat van de toegepaste therapeutische methode als gevolg van de aanwezigheid van bespaard weefsel. Het volledige transect model is de meest rigoureuze methode om aan te tonen van axon regeneratie.

Diverse natuurlijke en synthetische materialen zijn bestudeerd voor gebruik als een injecteerbare gel, een pre-gevormde gel in kneuzingen of hemisection modellen, of als een gestructureerde conduit in hemisection geplaatst of voltooien transect modellen (gedetailleerd in de beoordelingen23 , 24 , 25). in situ gelerend van een mengsel van injecteerbare matrix/SC maakt een meer tolerante interface tussen de transplantatie, het snoer van de gastheer voor axon kruising26,27 ten opzichte van vooraf gegeleerde matrix/SC implantaten 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelerend de matrix contour rond de onregelmatige host-interfaces, overwegende dat een meer rigide en gestructureerde conduit of een minder vormbare pre-gevormde gel kon niet toegestaan. Een gestructureerde conduit biedt vaak contact begeleiding en implantaat stabiliteit in tegenstelling tot een injecteerbare matrix. De protocollen die hier gepresenteerd beschrijven een chirurgische ingreep die maakt gebruik van zowel een injecteerbare kelder membraan-matrix (bijvoorbeeld matrigel, zie die de Tabel van materialen, bedoeld als injecteerbare matrix hier) en een gestructureerde conduit te evalueren van axon regeneratie in de meest rigoureuze ruggenmerg letsel model.

Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) uitgelijnd vezelig holle leidingen worden gebruikt in onze experimentele aanpak. PVDF-TrFE is een piëzo-elektrische polymeer dat genereert een voorbijgaande lading wanneer mechanisch vervormd en is aangetoond dat het bevorderen van de uitbreiding en de axon regeneratie van de neurite zowel in vitro29,30 en in vivo 31. Electrospinning is een gemeenschappelijk steiger fabricage methode die kan snel produceren betrouwbare vezelig steigers met behulp van een verscheidenheid van polymeren met controleerbare eigenschappen zoals uitlijning van de vezels, de diameter van de vezel en dikte van de steiger voor neurale en andere toepassingen32,33,34.

Talrijke studies van rat SCs getransplanteerd in ruggenmerg letsel sites hebben aangetoond dat behandeling werkzaamheid5,9,18,19,20,21 ,26. Deze transplantaties zijn neuroprotectieve voor weefsel rondom de laesie, laesie holte verkleinen, en bevorderen van axon regeneratie in de laesie/transplantatie site en de myelinisering van de geregenereerde axonen. Menselijke SCs autologously kunnen worden getransplanteerd, een voordeel in vergelijking met de meeste andere neurale-gerelateerde cellen24. Na een biopsie van de perifere zenuwen, SCs kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd en zal verspreiden tot het gewenste bedrag voor transplantatie in mensen. Autologe transplantatie van de SC voor ruggenmerg gewonde patiënten is bewezen veilig in Iran35,36,,37,38, China39,40, en de Verenigde Staten41,42. SCs staan bekend om afscheiden van talrijke neurotrophic factoren en extracellulaire matrix eiwitten belangrijk voor de groei van de axon en een essentiële rol te spelen bij axon regeneratie na perifere zenuw verwonding. Ons doel hier is om te beschrijven van methoden die conduit ontwerpen onderzoeken kunnen ter verbetering van de resultaten van SC transplantatie in een volledige rat ruggenmerg transect model.

Protocol

vrouwelijke volwassen Fischer ratten (180-200 g lichaamsgewicht) volgens de NIH en USDA richtlijnen zijn ondergebracht. De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami alle dierlijke procedures afgekeurd. 1. pre transplantatie voorbereiding Conduit voorbereiding. Gesneden de leiding tot 5 mm in lengte met een #10 mes onder een Microscoop ontleden. Opmerking: De inwendige diameter van de leiding is tussen 2.4-2…

Representative Results

Het doel van het gebruik van deze chirurgische techniek is om het gebruik van een gestructureerde conduit en injecteerbare matrix dat SC functie na transplantatie in voltooide verbeelde spinal koorden maximaliseert te evalueren. Drie weken na de transplantatie, de dieren zijn geperfundeerd met 4% paraformaldehyde en de spinale kolommen zijn grove ontleed en vastgesteld in de dezelfde fixeerspray voor een andere 24 h. Het ruggenmerg is vervolgens ontleed en de monsters voor de cryostaat Sa…

Discussion

De meest kritische stap in het creëren van een effectieve transect model is het doorsnijden van het ruggenmerg in één of twee delen. Een 2-2.5 mm kloof tussen de rostraal en caudal ruggenmerg stompen moet aanwezig zijn op de site van transect. De drie meest waarschijnlijke redenen voor dergelijke een kloof niet weergegeven zijn (1) de dorsale/ventrale wortels niet correct verwijderd, (2) de ventrale dura niet adequaat is verwijderd, en/of (3) het dier was niet goed gepositioneerd op de rol geplaatst onder haar.

<p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij wil bedanken de virale Vector en dier Cores bij het Project van de Miami tot verlamming van de remedie voor produceren de lenti-GFP-virus en bieden dierenverzorgers, respectievelijk, de histologie en Imaging Cores voor het gebruik van de cryostaat, confocal microscoop, en fluorescente microscoop met Stereo-Detective. Financiering werd verstrekt door NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) en NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge is de Christine E Lynn Distinguished Professor of Neuroscience.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. . Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -. S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. . Progress in Brain Research. , (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B., Lane, E. L., Dunnett, S. B. . Animal Models of Movement Disorders: Volume II. , 381-399 (2011).

Tags

Schwann CellsPVDF-TrFE ConduitsSpinal Cord TransectionAxon RegenerationLaminectomyRat ModelSurgical Procedure
check_url/56077?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image