JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Transplantasjon av Schwann celler inne PVDF-TrFE rør å bygge bro Transected Rat ryggmargen stubber fremme Axon foryngelse over gapet

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Denne artikkelen beskriver en teknikk for å sette inn en hul kanal mellom ryggmargen stubber etter fullført transection og fyll med Schwann cellene (SCs) og injiserbare kjelleren membran matrise for å bygge og markedsføre axon gjenfødelse på gapet.

Abstract

Blant ulike modeller for ryggmargsskade i rotter brukes oftest contusion modellen fordi det er den vanligste typen menneskelige ryggmargsskade. Komplett transection modellen, er men ikke som klinisk relevante som contusion modell, den strengeste metoden å evaluere axon gjenfødelse. I contusion modellen er det vanskelig å skille gjenskapte fra spiret eller spart axons av gjenværende vev innlegg skade. Komplett transection modellen er bygge bro metode nødvendig å fylle gapet og opprette kontinuitet fra den rostral til de caudal stumper for å vurdere effektiviteten av behandlingene. En pålitelig bygge bro kirurgi er viktig å teste utfallsmål ved å redusere variasjon på grunn av kirurgiske metoden. Protokollene beskrives her brukes til å forberede Schwann celler (SCs) og kanaler før transplantasjon, fullstendig transection i ryggmargen i thorax level 8 (T8), sette kanal og transplantere SCs i kanal. Denne fremgangsmåten bruker også i situ gelling av en injiserbare kjelleren membran matrise med SC transplantasjon som gir forbedret axon vekst over de rostral og caudal grensesnittene med vert vev.

Introduction

Ryggmarg skade reparasjon er et komplisert og utfordrende problem som krever en kombinasjon behandling strategi som involverer, for eksempel, bruk av celler og en biomateriale å gi en gunstig microenvironment for transplantert celle funksjon og axon regenerering på stedet for skade. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 og komplett transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modeller brukes ofte til å vurdere effekten av biomateriale-basert bygge bro behandling. Fordelen med å bruke en hemisection modell er at det gir mer stabilitet for bygge bro Konstruer sammenlignet med komplett transection. I hemisection modeller er det imidlertid vanskelig å bevise axon fornyelse som et resultat av anvendt terapeutiske metoden på grunn av tilstedeværelsen av spart vev. Komplett transection modellen er den strengeste metoden å demonstrere axon gjenfødelse.

Ulike naturlige og syntetiske materialer har blitt studert som en injeksjon gel, en pre-formet gel plassert i contusion eller hemisection modeller, eller som en strukturert kanal i hemisection eller fullføre transection modeller (detaljert i anmeldelser23 , 24 , 25). in situ gelling en injiserbare matrise/SC blanding oppretter et mer ettergivende grensesnitt mellom transplantasjon og vert ledningen for axon krysset26,27 sammenlignet pre gelled matrise/SC implantater 5 , 18 , 19 , 28. i situ gelling tillatt matrix å kontur rundt de uregelmessig vertsgrensesnitt mens en mer rigid og strukturert kanal eller en mindre formes pre-formet gel ikke kan. En strukturert kanal gir ofte kontakt veiledning og implantat stabilitet i motsetning til en injiserbare matrise. Protokollene presenteres her beskriver et kirurgisk inngrep som utnytter en injiserbare kjelleren membran matrise (f.eks matrigel, se Tabell av materialer, referert til som injiserbare matrix her) og en strukturert kanal til evaluere axon fornyelse i de strengeste ryggmarg skade modellen.

Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) justert fibrøs hult rør brukes i vår eksperimentelle tilnærming. PVDF-TrFE er en piezoelectric polymer som genererer en forbigående kostnad når mekanisk deformert og har vist seg å fremme neurite forlengelse og axon regenerering både i vitro29,30 og i vivo 31. Electrospinning er en vanlig stillaset fabrikasjon metode som kan raskt produsere pålitelige fibrøs stillaser bruker en rekke polymerer med kontrollerbar egenskaper som fiber justering, fiber diameter og tykkelsen på skafottet for nevrale og andre programmer32,33,34.

Tallrike studier av rotte SCs transplantert inn i ryggmargen skaden nettsteder har vist behandling effekt5,9,18,19,20,21 ,26. Disse transplantasjoner er neuroprotective for vevet rundt lesjonen, redusere lesjon hulrom størrelse og fremme axon regenerering i lesjon/transplantasjon området og myelination av gjenfødte axons. En fordel i forhold til de fleste andre neural-relaterte celler24menneskelige SCs kan transplanteres autologously. Etter en ekstern nerve biopsi, SCs kan være isolert og renset og vil spre seg til det ønskede beløpet for transplantasjon i mennesker. Autolog SC transplantasjon for ryggmargen skadet pasienter har vist seg for å være trygg i Iran35,36,37,38, Kina39,40, og USA41,42. SCs er kjent for å skille ut mange nevrotropisk faktorer og ekstracellulær matrix proteiner viktig for axon vekst og spille en viktig rolle i axon regenerering etter eksterne nerve skader. Vårt mål er å beskrive metoder som kan undersøke kanal design å forbedre resultatet av SC transplantasjon i en komplett rotte ryggmargen transection modell.

Protocol

voksen Fischer hunnrotter (180-200 g kroppsvekt) ligger i henhold til NIH og USDA retningslinjer. Institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Miami godkjent alle dyr prosedyrer. 1. før transplantasjon forberedelse kanal forberedelse. Kutt på kanal 5 mm i lengde med et #10 blad under dissecting mikroskop. Merk: Den indre diameteren på kanal er mellom 2.4-2.7 mm; den ytre diameteren er mellom 2,5-2,8 mm. Brett…

Representative Results

Målet med å bruke denne kirurgiske teknikken er å vurdere bruken av et strukturert kanal og injiserbare matrisen som maksimerer SC funksjon etter transplantasjon til ferdigutfylte transected spinal snorer. Tre uker etter transplantasjon, dyrene er parfyme med 4% paraformaldehyde og spinal kolonnene er grovt dissekert og fast i den samme bindemiddel for en annen 24 timer. Ryggmargen er så dissekert og prøvene for kryostaten sagittal inndelinger er plassert i en 30% sukrose løsning fo…

Discussion

Det viktigste trinnet i å skape en effektiv transection modell er kuttet ryggmargen i en eller to kutt. En 2-2.5 mm avstand mellom rostral og caudal ryggmargen stubber bør være til stede på transection nettstedet. Tre mest sannsynlige årsakene til slikt tomrom vises ikke er (1) dorsal/ventrale røtter ikke ble riktig fjernet, (2) ventrale dura ble ikke fjernet tilstrekkelig eller (3) dyret var ikke plassert riktig på roll plassert under henne.

Utføre en effektiv kanal innsetting mellom …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Viral vektor og dyr kjerner på Miami prosjektet kur lammelse for produsere lenti-GFP-virus og gi dyr omsorg, henholdsvis og Histology og Imaging kjerner for bruk av kryostaten, AC confocal mikroskop, og fluorescerende mikroskop med Stereo etterforsker. Midler ble gitt av NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) og NSF (DMR-1006510). MB Bunge er Christine E Lynn Distinguished Professor av nevrovitenskap.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. . Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -. S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. . Progress in Brain Research. , (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B., Lane, E. L., Dunnett, S. B. . Animal Models of Movement Disorders: Volume II. , 381-399 (2011).

Tags

Schwann CellsPVDF-TrFE ConduitsSpinal Cord TransectionAxon RegenerationLaminectomyRat ModelSurgical Procedure
check_url/56077?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image