JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Transplantation av Schwann celler inuti PVDF-TrFE ledningar att överbrygga Transected råtta ryggmärgen stubbar för att främja Axon regenerering över gapet

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Denna artikel beskriver en teknik för att infoga en ihålig kanal mellan ryggmärgen stubbarna efter komplett transection och fylla med Schwann celler (SCs) och injicerbara basalmembranet matris för att överbrygga och främja axon regenerering över gapet.

Abstract

Bland olika modeller för ryggmärgsskada hos råttor används kontusion modellen oftast eftersom det är den vanligaste typen av mänskliga ryggmärgsskada. Den kompletta transection modellen, är även om inte vara kliniskt som kontusion modell, den mest rigorösa metoden att utvärdera axon regenerering. I den kontusion modellen är det svårt att skilja regenererad från grodda eller avvarad axoner på grund av återstående post vävnadsskada. I komplett transection modellen är en överbryggande metod nödvändigt att fylla tomrummet och skapa kontinuitet från den rostralt till stjärtfenan stubbarna för att utvärdera effektiviteten av behandlingarna. En tillförlitlig överbryggande kirurgi är viktigt att testa resultatåtgärder genom att minska variationen på grund av den kirurgiska metoden. De protokoll som beskrivs här används för att förbereda Schwann celler (SCs) och conduits före transplantation, komplett transection av ryggmärgen på thorakal nivå 8 (T8), infoga specialföretaget och transplantera SCs till specialföretaget. Detta tillvägagångssätt används också i situ gelbildande av en injicerbara basalmembranet matris med SC transplantation som tillåter förbättrad axon tillväxt över de rostralt och stjärtfenan gränssnitt med värd vävnaden.

Introduction

Ryggmärgen skada reparation är komplexa och utmanande problem som kommer att kräva en kombinatorisk behandlingsstrategi som t.ex, användning av celler och en biomaterial att ge en gynnsam närmiljön för transplanterade cellernas funktion och axon förnyelse på platsen av skada. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 och komplett transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modeller används ofta för att bedöma effekterna av biomaterial-baserade överbryggande behandlingar. Fördelen med att använda en hemisection modell är att det ger mer stabilitet för den överbryggande konstruktion jämfört med komplett transection. I hemisection modeller är det dock svårt att bevisa axon förnyelse som ett resultat av den terapeutiska metoden som tillämpas på grund av förekomsten av avvarad vävnad. Komplett transection modellen är den mest rigorösa metoden att påvisa axon regenerering.

Olika naturliga och syntetiska material har studerats för användning som en injicerbar gel, en förformad gel placeras i kontusion eller hemisection modeller, eller som en strukturerad kanal i hemisection eller slutföra transection modeller (detaljerad i recensioner23 , 24 , 25). i situ gelbildande av blandningen injicerbara matris/SC skapar ett mer tillåtande gränssnitt mellan transplantationen och värd sladden för axon korsar26,27 jämfört med före geléartad matris/SC implantat 5 , 18 , 19 , 28. i situ gelbildande tillåtna matrisen till kontur runt de oregelbundna host gränssnitt medan en mer styv och strukturerad conduit eller mindre formbara förformad gel inte kunde. En strukturerad conduit ger ofta kontakt vägledning och implantatet stabilitet i motsats till en injicerbara matris. De protokoll som presenteras här beskriva ett kirurgiskt ingrepp som drar nytta av både en injicerbara basalmembranet matris (t.ex. matrigel, se Tabell av material, avses som injicerbara matris här) och en strukturerad kanal till utvärdera axon förnyelse i den mest rigorösa ryggmärgen skadan modellen.

Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoreten (PVDF-TrFE) arrangera i rak linje fibrösa ihåliga conduits används i våra experimentella tillvägagångssätt. PVDF-TrFE är en piezoelektrisk polymer som genererar en övergående avgift när mekaniskt deformeras och har visat sig främja neurite förlängning och axon förnyelse både in vitro-29,30 och i vivo 31. Electrospinning är en vanlig byggnadsställning fabrication metod som kan snabbt producera tillförlitlig fibrösa ställningar med hjälp av olika polymerer med kontrollerbara egenskaper såsom fiber justering, fiber diameter och tjocklek av ställningen för neurala och andra program32,33,34.

Många studier av råtta SCs transplanteras i ryggmärgen skadan platser har visat behandling effekt5,9,18,19,20,21 ,26. Dessa transplantationer är nervskyddande för vävnaden som omger lesionen, minska lesionsstorlek hålighet och främja axon förnyelse i lesionen/transplantation webbplats och myelinisering av regenererad axoner. Mänskliga SCs kan transplanteras autologously, en fördel jämfört med de flesta andra neurala-relaterade celler24. Efter en perifer nerv biopsi, SCs kan vara isolerade och renade och kommer att skena iväg till önskad mängd för transplantation till människor. Autolog SC transplantation för ryggmärg skadade patienter har visat sig vara säkra i Iran35,36,37,38, Kina39,40, och den Sverige har41,42. SCs är kända att utsöndra talrika neurotrofa faktorer och extracellulära matrix proteiner viktiga för axon tillväxt och att spela en viktig roll i axon förnyelse efter perifer nervskada. Vårt mål här är att beskriva metoder som kan undersöka conduit mönster för att förbättra resultatet av SC transplantation i en komplett råtta ryggmärgen transection modell.

Protocol

vuxen Fischer honråttor (180-200 g kroppsvikt) är inrymt enligt NIH och USDA riktlinjer. De institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Miami godkända alla djur förfaranden. 1. före Transplantation utarbetandet Conduit förberedelse. Klipp specialföretaget till 5 mm i längd med hjälp av en #10 blad i dissekera Mikroskop. Obs: Den inre diametern av specialföretaget är mellan 2,4-2,7 mm; den yttre diameter…

Representative Results

Målet med denna operationsteknik är att utvärdera användningen av en strukturerad conduit och injicerbara matris som maximerar SC funktion efter transplantation in ifyllda transected ryggmärg. Tre veckor efter transplantation, djuren är perfusion med 4% PARAFORMALDEHYD och spinal kolumnerna är grovt dissekeras och fast i den samma fixativ för en annan 24 h. Ryggmärgen är sedan dissekerade och proverna för kryostaten sagittal sektioner placeras i en 30% sackaroslösning för cry…

Discussion

Det viktigaste steget i att skapa en effektiv transection modell är severing ryggmärgen i en eller två nedskärningar. Ett 2-2,5 mm gap mellan rostralt och stjärtfenan ryggmärgen stubbarna bör förekomma på webbplatsen transection. Av tre mest sannolika skäl för sådan lucka inte visas är (1) dorsala/ventrala rötterna inte togs bort ordentligt, (2) den ventrala Duran togs inte bort tillräckligt eller (3) djuret var inte rätt placerade på rulle placeras under henne.

Att utföra en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka de virala vektorn och djur kärnor på Miami projektet till bota förlamning för producerar den lenti-GFP-virus och ge Djurvård, respektive, histologi och Imaging kärnor för användning av kryostaten, confocal mikroskopet, och fluorescerande Mikroskop med Stereo utredare. Finansieringen tillhandahölls av NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) och NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge är det Christine E Lynn Distinguished Professor i neurovetenskap.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. . Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -. S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. . Progress in Brain Research. , (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B., Lane, E. L., Dunnett, S. B. . Animal Models of Movement Disorders: Volume II. , 381-399 (2011).

Tags

Schwann CellsPVDF-TrFE ConduitsSpinal Cord TransectionAxon RegenerationLaminectomyRat ModelSurgical Procedure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image