体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価
Summary
感覚機能の異常は、内臓の痛みや機能および炎症性腸病気の他の症状に基づいています。に備えて、前のヴィヴォラット大腸結腸求心性神経の電気生理学的記録のためのプロトコルを次に示します。
Abstract
大腸の感覚神経の機能不全は、いくつかの一般的な条件、機能と炎症性腸疾患、糖尿病などの病態に関与しています。ここでは、ラットの結腸求心性神経の電気生理学的特性の in vitro評価プロトコルについて述べる。アタッチすると、そのまま骨盤神経節 (PG) と、大腸がラット;隔 carbogenated 録音室でクレブス ソリューション膨満感を許可する口腔と肛門の端に ● キャニュレイテッド。PG から発せられる細かい神経束が識別され、吸引電極を用いたニューロン求心性神経活動が記録されます。大腸のセグメントの膨満は、ニューロンの放電の漸進的な増加を引き出します。主成分分析は、低閾値、高しきい値、広ダイナミック レンジの求心性線維を区別するために行われています。テスト混合物のバスタブまたは腔内投与による結腸求心性神経の化学物質過敏症を学ぶことができます。このプロトコルは、他の種、マウスやモルモットなどと正常で下行結腸の胸腰椎/下腹と腰仙部/骨盤求心性神経の電気生理学的特性の差異を検討するためにアプリケーションで変更できるし、病理学の条件。
Introduction
消化管 (GIT の)、豊かな中枢神経系に腸からの感覚信号を伝えることと、腸と脳との対話に貢献する外因性の求心性神経で支配されています。これらの外因性求心性神経の変更された興奮性および求心性入力の変更された中央処理内臓痛と機能と炎症性腸疾患1を含む GI 条件の他の症状に基づいています。大腸からの感覚情報は、主に胸腰椎/下腹と腰仙部/骨盤神経 (PN)2を通じて伝達されます。齧歯動物疾患モデルでこれらの一次求心性線維の電気生理学的性質の研究に関心の高まりがあった。しかし、齧歯動物で結腸求心性神経の電気生理学的記録体内は技術的な課題は、手術のかなりのスキルが必要です。さらに、血行動態、組織の動き、および麻酔薬も影響を与えます神経活動と体内の刺激テストする感度。したがって、近年、研究の増加する数は生体外で(前のヴィヴォ) 準備人間、モルモット、マウス、ラットなど種の結腸における感覚情報伝達のメカニズムを調べるを採用しました。求心性神経と病気の条件に変更された興奮性。3,4,5,6,7,8
前のヴィヴォ下部消化管手術の 2 種類が主に報告されている:「フラット シート」準備5,9,10 「チューブ」準備3,4。「フラット シート」マウス大腸準備のためビデオ プロトコルは、以前に発行された11をされています。このプロトコルはマウス大腸、pn) で接続、腰部の内臓神経 (LSN) は収穫と隔組織の商工会議所または。大腸は縦、切り開かれ、神経束は、パラフィン オイルが充填された記録のコンパートメントに拡張されます。モノポーラ プラチナ イリジウム電極を用いた神経活動が記録されます。プロトコルは個々 の求心性線維の受容野の同定のため公平な電気刺激によることができます。それは化学的刺激のアプリケーションだけでなく、異なる機械的刺激パラダイムのアプリケーションをローカライズする (例えば、焦点粘膜プロービングと円周方向引張)、求心性神経終末へ。神経は、組織室から別の部屋に拡張する必要があります、ので比較的長い; 添付の神経を維持する重要です。神経の正常解剖この方法に新しいものに問題が生じます。最近では、Nullensらは、マウスの腸と大腸セグメント12求心系の腸間膜の培養記録用ビデオ プロトコルを公開しました。この「チューブ」準備の添付腸間膜を持つ腸セグメントはそのままに、こうして傾斜膨満感と異なる化学物質の内、余分な内腔の管理を可能にする保持されます。組織の近くに置くことができる、吸引電極を用いた腸間膜神経が記録されますので、腸間膜神経は比較的短いにもかかわらず、求心性活動を記録できます。しかし、腸間膜神経が腸を支配する迷走神経および脊髄の求心性線維の混合集団の構成や胸腰椎下腹。腰部骨盤求心性神経は、このプロトコルで差別されることはできませんが大腸を刺激する.ここでは、そのままのページで「チューブ」大腸製剤を用いたラット結腸求心性神経の電気生理学的記録のための詳しいプロトコルを提案します。この方法は内臓腰椎の機能特性の評価ができる (下腹) と腰仙部骨盤求心性神経。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されたプロトコルは、ラットの結腸求心性神経の電気生理学的特性を評価するために比較的簡単な実験です。(神経記録を設定する組織郭清) からプロトコルを完了する約 2 時間がかかります。組織コレクション (ステップ 3) 吸引電極 (手順 5) の作成は、重要なステップ。PG、LSN、PN を特定し、組織解剖時に神経節と神経を損傷しないように注意することが重要です。ガラス ピペッ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルは、国家自然科学基金、中国の (#31171066 #81270464) と中国とドイツ科学センター (GZ919) からの研究補助金によって支えられました。
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3. r. d., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
