Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux
Summary
Le protocole AWESAM décrit ici est optimal pour la culture des astrocytes murines isolément des autres cellules du cerveau une manière rapide, simple et peu coûteux. AWESAM astrocytes présentent spontanée Ca2 + signalisation, la morphologie et génétique des profils d’expression semblables aux astrocytes in vivo.
Abstract
Le AWESAM (un low– easy stellate unestrocyte modes de coûts) protocole implique un moyen rapide, simple et peu coûteux de produire de grandes quantités de in vivo-comme la souris et le rat des monocultures astrocyte : Cerveau cellules peuvent être isolées de différentes régions du cerveau, et après une semaine de culture cellulaire, les cellules non-astrocytaires sont secoués en plaçant les récipients de culture sur un agitateur pendant 6 h dans l’incubateur. Les astrocytes restants sont ensuite repiquées dans les nouvelles plaques avec un milieu astrocyte spécifiques (appelé NB + H). NB + H contient des concentrations faibles heparin-binding EGF-like du facteur de croissance (HBEGF), qui est utilisé à la place de sérum dans le milieu. Après une croissance en NB + H, astrocytes AWESAM ont une morphologie stellaire et les longs processus fine. En outre, ces astrocytes ont plus en vivo-comme l’expression des gènes que les astrocytes générées par les méthodes publiées antérieurement. Ca2 + imagerie, la dynamique de la vésicule et autres événements à proximité de la membrane peuvent ainsi être étudiés dans le processus astrocytaires fine in vitro, par exemple, à l’aide de cellules vivantes confocale ou microscope TIRF. Notamment, AWESAM astrocytes présentent aussi spontanée Ca2 + signalisation similaires aux astrocytes in vivo.
Introduction
Astrocytes influencent le fonctionnement du cerveau par le biais de soutien trophique, débit sanguin, signalisation synaptique et plasticité et la communication intercellulaire – qui sont tous des mécanismes qui centré autour des processus astrocytaires minces. Le protocole AWESAM décrit ici permet l’étude de ces processus sans interférence des neurones et autres cellules gliales, qui est utile par exemple, car l’expression de nombreuses protéines et même Ca2 + signalisation se chevauchent dans la cellule du cerveau différentes types. En outre, cette méthode surmonte les limites des techniques déjà disponibles. En particulier, notre protocole prévoit en vivo-comme la morphologie (astrocytes stellaires avec les processus minces) et l’expression des gènes dans un rapide, facile et la manière bon marché.
La morphologie cellulaire, l’expression des gènes et nombreux autres processus réglementaires sont directement influencées par l’environnement. Dans une boîte de Petri, il s’agit des facteurs libérés par les cellules environnantes, mais aussi le milieu dans lequel les cellules sont cultivées. Pour les astrocytes, HBEGF a été signalé auparavant pour induire une morphologie stellaire1 mais s’est avéré également pour différencier des astrocytes2. Cependant, des concentrations plus faibles de HBEGF ont été plus tard utilisées à produire plus en vivo-comme les astrocytes identifiés par séquençage de RNA dans deux protocoles différents3,4. En outre, la morphologie astrocytaire change avec la composition du milieu, quel que soit le protocole n°4: Neurobasal moyen avec une faible concentration de HBEGF est optimale pour la culture des astrocytes stellaires, tandis que d’autres compositions moyennes (par exemple, sérum contenant DMEM) produisent des cellules polygonales (même dans les astrocytes fraîchement isolées par immunopanning).
Le protocole AWESAM surmonte les inconvénients techniques précédentes pour astrocyte monocultures4de plus en plus. Les techniques précédentes pour la culture de monocultures astrocyte ont les inconvénients suivants : morphologie polygonale, qui est inhabituelle des astrocytes stellaire en vivo (méthode de MD)5; la longueur et le coût du protocole (préparation des astrocytes de prend des cellules souches pluripotentes induites trois mois et nécessite de nombreux réactifs, y compris les facteurs de croissance coûteuses)6; les faibles quantités de matière (méthode immunopanning)3; la dédifférenciation des astrocytes et exigence d’une matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. en revanche, le protocole AWESAM offre : en vivo-comme la morphologie (astrocytes stellaires avec les processus minces) ; un rapide, facile et la méthode bon marché ; grandes quantités de matériel ; et le plus en vivo-comme l’expression des gènes par rapport à immunopanned et astrocytes MD. De plus, la culture 2D permet l’étude de signalisation Ca2 + et de recyclage dans les processus de minces et dans les événements à proximité de la membrane de vésicules (p. ex., microscope TIRF n’est pas possible dans les cultures 3D).
La méthode de MD a été largement utilisée depuis sa publication en 19805, propose une technique simple et rapide pour les monocultures astrocyte polygonale. En bref, la méthode de MD entraîne les cellules du cerveau mixtes croissant dans le sérum de veau foetal (FCS)-contenant DMEM, suivi en secouant les étapes qui enrichissent des astrocytes (comme toutes les autres cellules du cerveau types se détachent de la capsule) et la culture plus loin dans le même milieu. DMEM supplémenté avec FCS est utilisé pour de nombreux autres types de cellules, allant des fibroblastes et des adipocytes aux lignées cellulaires de cancer différents, qui partagent tous la morphologie polygonale exposée par les astrocytes MD dans la culture. Jusqu’au début des années 20007, peu d’attention a été accordée aux médias adaptés aux astrocytes, plus précisément à favoriser leur morphologie stellaire typique trouvé in vivo. Un seul protocole publié en 2011 réaliser cette morphologie stellaire : appelle la méthode immunopanning, elle emploie un milieu sans sérum optimisé pour la culture des astrocytes3. En utilisant cette méthode, les cellules du cerveau fraîchement isolées sont exposés à une série de plats recouverts d’anticorps qui ciblent les protéines de surface cellulaire spécifique de type cellulaire, d’enrichir pour les astrocytes. Malgré le plus en vivo-comme profil de morphologie et d’expression des astrocytes d’immunopanned, la majorité des études in vitro dépendre encore de la méthode d’astrocyte MD. La méthode de MD est simple et rapide, tandis que la méthode d’immunopanning compte les plus complexes et fastidieuses étapes sur la première journée de la culture (telles que de plus longues périodes de digestion enzymatique, prudente superposition de solutions de densité différente, immunopanning lui-même, et plusieurs centrifugation pas – tout avant l’ensemencement). Cependant, en utilisant le médium plus spécialisé, la méthode AWESAM offre fois la rapidité de la méthode de MD et de l’ in vivo-comme la morphologie du protocole immunopanning.
Dans l’ensemble, le protocole AWESAM est utile pour étudier plus en vivo-comme les astrocytes en monocultures 2D isolées de neurones et autres cellules gliales (comme déjà4 par séquençage de RNA immunostainings et immuno-Blot). Il permet l’étude des processus astrocytaires minces et fournit la grande accessibilité de visualisation spontanée de Ca2 + de signalisation et des événements à proximité de la membrane (p. ex., photographié par microscopie FRBR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Quatre étapes dans le protocole sont critiques : 1) préparer la concentration HBEGF à exactement 5 ng/mL, car de petites augmentations de la concentration peuvent conduire à des cultures immatures, par exemple, 10 ng/mL HBEGF différenciera des astrocytes4; 2) en évitant de bulles dans les solutions qui contiennent des tissus ou des cellules, qui peuvent changer le pH et diminuer la santé de l’astrocyte ; 3) équilibration des médias pour atteindre le pH optimal et la températ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le financement de l’European Research Council (FP7/260916), l’Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 et SFB889).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
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