In Vivo Detectie en analyse van Rb eiwit SUMOylation in menselijke cellen
Summary
Kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO) familie eiwitten zijn geconjugeerd lysine residuen van doel eiwitten voor het regelen van diverse cellulaire processen. Dit witboek beschrijft een protocol voor de detectie van Retinoblastoom (Rb) eiwit SUMOylation onder endogene en exogene voorwaarden in menselijke cellen.
Abstract
De posttranslationele modificaties van eiwitten zijn kritisch voor de juiste regulering van intracellulaire signaaltransductie. Onder deze wijzigingen is kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO) een ubiquitin-achtig eiwit dat covalent lysine residuen van een verscheidenheid van target eiwitten vastzit te reguleren van cellulaire processen, zoals gene transcriptie, DNA-reparatie, eiwit interactie en afbraak, subcellular vervoer en signaaltransductie. De meest gemeenschappelijke aanpak voor het opsporen van eiwit SUMOylation is gebaseerd op de expressie en de zuivering van recombinante tagged eiwitten bij bacteriën, waardoor voor een in vitro biochemische reactie is eenvoudig en geschikt voor adressering mechanistische vragen. Als gevolg van de complexiteit van het proces van SUMOylation in vivois het echter moeilijker te detecteren en analyseren van eiwitten in cellen, met name wanneer omstandigheden endogene SUMOylation. Een recente studie door de auteurs van deze paper openbaarden dat endogene Retinoblastoom (Rb) eiwit, een tumor suppressor dat is essentieel voor de negatieve regulering van de celcyclus, specifiek SUMOylated in de vroege fase van de G1. Dit witboek beschrijft een protocol voor de detectie en analyse van Rb SUMOylation onder zowel endogene als exogene voorwaarden in menselijke cellen. Dit protocol is geschikt voor het onderzoek van het phenotypical en functionele SUMO-wijziging van de Rb, evenals vele andere SUMO-gerichte eiwitten bevatten, in menselijke cellen.
Introduction
De nauwkeurige controle van de celcyclus in eukaryote cellen is gebaseerd op een strakke regelgeving netwerk, die ervoor zorgt dat bepaalde gebeurtenissen in een geordende wijze1,2 plaatsvinden. Een van de hoofdrolspelers in dit netwerk is het Retinoblastoom (Rb) eiwit, de eerste gekloonde tumor suppressor1,3. De Rb-eiwit wordt beschouwd als een negatieve regelgever van de celcyclus, vooral voor de G0/G1 te S faseovergang,4,5van de groei van de tumor. Gebrekkige werking van de Rb van hetzij rechtstreeks leidt tot de meest voorkomende intraoculaire maligniteit bij kinderen, retinoblastoom, of draagt bij aan de ontwikkeling van vele andere soorten kanker5. Bovendien, Rb is betrokken bij veel cellulaire routes, met inbegrip van celdifferentiatie, chromatine-remodeling en apoptosis mitochondriën-gemedieerde3,6,7.
Posttranslationele modificaties spelen een sleutelrol bij de regulering van RB functie8,9. Fosforylering is een dergelijke wijziging, en het leidt meestal tot Rb inactivatie. In rustige G0 cellen is Rb actief met een lage fosforylatie niveau. Als cellen vooruitgang door middel van G0/G1-fase, is Rb sequentieel hyper-phosphorylated door een reeks van cycline-afhankelijk proteïne kinases (CDKs) en cyclines, zoals cycline E/CDK2 en cycline D/CDK4/6, die de inactivering van Rb en elimineren van haar vermogen om het onderdrukken van de celcyclus gerelateerde gen expressie4,10. RB kan ook worden gewijzigd door kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO)11,12,13.
SUMO is een ubiquitin-achtig eiwit die covalent is gekoppeld aan een verscheidenheid van target eiwitten. Het is van cruciaal belang voor diverse cellulaire processen, waaronder celcyclus verordening, transcriptie, cellulaire eiwit-lokalisatie en afbraak, vervoer en DNA herstellen14,15,16, 17 , 18. de SUMO vervoeging traject bestaat uit het dimeric SUMO E1 activerend enzym SAE1/UBA2, de één E2 conjugating enzym Ubc9, meerdere E3 ligases en SUMO-specifieke proteasen. In het algemeen, ontluikende SUMO eiwitten moeten proteolytically worden verwerkt voor het genereren van de volwassen vorm. De volwassen SUMO is geactiveerd door de heterodimer van de E1 en vervolgens overgebracht naar het E2-enzym Ubc9. Ten slotte, de C-terminal glycine van SUMO is covalent geconjugeerd met het doel lysine van een substraat, en dit proces wordt meestal vergemakkelijkt door E3 ligases. De SUMO-eiwit kan worden verwijderd uit het gemodificeerde substraat door specifieke proteasen. Een eerdere studie door de auteurs van deze paper bleek dat SUMOylation van Rb zijn binding aan CDK2 verhoogt, leiden tot hyper-fosforylatie in de vroege fase van de G1, een proces die nodig voor de celcyclus progressie13 is. We toonden ook aan dat het verlies van Rb SUMOylation een verminderde celproliferatie veroorzaakt. Bovendien werd onlangs aangetoond dat de SUMOylation van Rb de Rb proteïne remmen omzet beschermt, waardoor het niveau van de Rb eiwitten in cellen19. Daarom speelt SUMOylation een belangrijke rol in functie van de Rb in diverse cellulaire processen. Verdere studie de functionele gevolgen en de fysiologische relevantie van Rb SUMOylation, het is belangrijk om een effectieve methode voor het analyseren van de SUMO status van Rb in menselijke cellen of weefsels van de patiënt.
SUMOylation is een omkeerbare en zeer dynamisch proces. Het is dus meestal moeilijk op te sporen van de SUMO gemodificeerde eiwitten volledig endogene omstandigheden. Dit document stelt een methode voor het detecteren van endogene Rb SUMOylation. Bovendien, het toont hoe te detecteren van exogene Rb SUMOylation van wild-type Rb én de SUMO-deficiënte mutatie11. In het bijzonder beschreven Jacobs et al. een methode voor het vergroten van de SUMO wijziging van een bepaald substraat specifiek door Ubc9 fusion geleide SUMOylation (UFDS)20. Dit protocol wordt op basis van deze methode, en beschreven hoe de gedwongen SUMOylation van Rb en de functionele gevolgen ervan te analyseren. Gezien het feit dat honderden SUMO substraten eerder beschreven zijn en meer vermeende SUMO substraten geconstateerd van vele proteomic gebaseerde testen, kan dit protocol worden toegepast om te analyseren de SUMO-wijziging van deze eiwitten in menselijke cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit witboek beschrijft een protocol om te detecteren en analyseren van de endogene SUMOylation van Rb in menselijke cellen. Als deze methode specifiek op de endogene Rb eiwit zonder een afwisseling van globale SUMO-gerelateerde signaal gericht is, is het een belangrijk instrument voor het onderzoeken van de Rb-SUMO wijziging volledig natuurlijke fysiologische omstandigheden.
Dit om doel te bereiken, is het belangrijk om in gedachten te houden dat: 1) Hoewel SUMO vier isoforms (SUMO1-4, elk doo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai (Grant nr. 14411961800) en de National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
